关键词外泌体技术服务、外泌体提取鉴定
当前，糖尿病伤口愈合面临的核心病理障碍在于巨噬细胞胞葬作用（efferocytosis）缺陷——凋亡细胞无法被及时清除，持续释放损伤相关分子模式，导致炎症信号恶性循环，组织修复停滞。传统的抗炎或促血管治疗难以从源头打破这一免疫失衡。在此背景下，干细胞来源外泌体因其天然介导细胞间通讯、携带多种生物活性分子的优势，成为调控免疫微环境的前沿研究方向。然而，裸外泌体在复杂伤口环境中稳定性差、易流失，如何实现其局部持久递送仍是临床转化的关键瓶颈。
今天分享的是一篇发表在【Bioact Mater.】（IF：23.6）上题为“Sprayable bioadhesive microcarriers loaded with Tβ4-Engineered ADSC exosomes for diabetic wound healing”的研究，该研究通过慢病毒转导构建过表达胸腺素β4（Tβ4）的工程化ADSCs，提取其外泌体（EXOs^Tβ4），利用微流控技术制备GelMA水凝胶微载体，并进一步用介孔聚多巴胺（mPDA）涂层功能化，形成可喷雾、生物粘附的EXOs^Tβ4/mPDA@MS微载体系统。该平台在糖尿病小鼠模型中通过激活MerTK/PI3K/Akt轴增强巨噬细胞胞葬作用，促进M2极化、减轻氧化应激，加速伤口愈合。
研究思路
1.明确关键障碍：糖尿病伤口愈合受阻的核心是巨噬细胞胞葬作用（efferocytosis）缺陷，导致凋亡细胞堆积、炎症持续和组织修复停滞。
2.设计工程化外泌体：通过慢病毒转染构建过表达Tβ4的ADSCs（ADSCs^Tβ4），提取其外泌体（EXOs^Tβ4），使外泌体富含Tβ4以增强免疫调节功能。
3.构建喷雾式微载体递送系统：利用微流控技术制备GelMA水凝胶微载体，将EXOs^Tβ4封装其中，并进一步用介孔聚多巴胺（mPDA）涂层功能化，形成可喷雾、湿态粘附的EXOs^Tβ4/mPDA@MS平台。
4.微载体性能表征：验证微载体的均匀球形形态、mPDA成功涂层、组织粘附力、溶胀行为及外泌体缓释特性。
5.体外功能验证：评估EXOs^Tβ4/mPDA@MS对巨噬细胞的生物相容性，验证其对胞葬作用、M2极化、ROS清除及炎症因子（iNOS、TNF-α、IL-18）的调控效果。
6.体内疗效评估：在STZ诱导的1型糖尿病和db/db 2型糖尿病小鼠全层皮肤缺损模型中，评估EXOs^Tβ4/mPDA@MS对伤口愈合率、上皮再生、胶原沉积和血管新生的促进作用。
7.机制解析：通过转录组学（RNA-seq）筛选关键通路，结合MerTK抑制剂（UNC2025）和siRNA沉默，验证EXOs^Tβ4/mPDA@MS通过激活MerTK/PI3K/Akt信号轴增强胞葬作用的分子机制。
8.安全性评估：通过CCK-8、活/死染色及体内组织学检查，确认微载体系统的生物相容性。
研究成果
1. EXOs^Tβ4/mPDA@MS的制备与治疗应用示意图
图1a：Tβ4工程化外泌体（EXOs^Tβ4）的制备流程：慢病毒转导ADSCs过表达Tβ4，收集培养上清提取外泌体。
图1b：微流控法制备EXOs^Tβ4/mPDA@MS微球：GelMA预聚液包裹EXOs^Tβ4作为内相，油相为外相形成液滴，UV交联固化后表面沉积mPDA。
图1c：EXOs^Tβ4/mPDA@MS促进糖尿病伤口愈合的机制：通过增强巨噬细胞胞葬作用、抑制炎症、促进M2极化，加速组织修复。
综上，该研究构建了从外泌体工程化到微载体喷雾递送的完整治疗平台。
2. Tβ4过表达ADSCs及EXOs^Tβ4的表征
图2a：Tβ4过表达ADSCs及外泌体提取的示意图。
图2b-c：荧光显微镜显示ADSCs^vector和ADSCs^Tβ4均表达GFP，转导效率>90%。
图2d、i：免疫荧光及定量显示ADSCs^Tβ4中Tβ4荧光强度显著高于ADSCs^vector。
图2e：TEM显示EXOs^vector和EXOs^Tβ4均呈典型杯状形态。
图2f-g：Western blot及定量显示ADSCs^Tβ4中Tβ4蛋白表达显著升高。
图2h：流式细胞术确认ADSCs转导后GFP表达效率>90%。
图2j-k：Western blot及定量显示EXOs^Tβ4中Tβ4蛋白显著富集。
图2l：NTA显示EXOs^vector和EXOs^Tβ4粒径均约150 nm，分布相似。
图2m：Western blot检测外泌体标志物TSG101、CD9、CD63阳性，Calnexin阴性。
以上结果表明，成功构建了Tβ4过表达的ADSCs，并分离出富含Tβ4的外泌体（EXOs^Tβ4），外泌体具有典型形态和标志物。
3. EXOs^Tβ4/mPDA@MS的制备与生物粘附表征
图3a：EXOs^Tβ4/mPDA@MS微载体的合成示意图。
图3b-c：明场图像和SEM显示EXOs^Tβ4@MS呈均匀球形，直径99.8±5.8 μm，表面光滑，内部多孔。
图3d-e：明场图像和SEM显示mPDA修饰后微载体呈深色不透明外观，直径100.4±6.2 μm，表面可见mPDA沉积。
图3f-g：猪皮粘附实验显示EXOs^Tβ4@MS经PBS冲洗后脱落，EXOs^Tβ4/mPDA@MS冲洗后仍牢固粘附。
图3h：FTIR显示mPDA@GelMA在~1670 cm⁻¹出现C=N亚胺峰，3300–3400 cm⁻¹宽峰增强，证实mPDA功能化。
图3i：溶胀实验显示两种微载体均具高吸水能力，EXOs^Tβ4/mPDA@MS溶胀率略低。
图3j：释放曲线显示EXOs^Tβ4/mPDA@MS较EXOs^Tβ4@MS具有更持续的外泌体释放。
结果表明，成功制备了均匀、可喷雾的mPDA功能化微载体，其具备优异的湿态粘附性和持续释放能力。
4. EXOs^Tβ4/mPDA@MS增强巨噬细胞胞葬作用并抑制炎症活化
图4a-b：荧光图像及定量显示EXOs^Tβ4/mPDA@MS组Raw264.7巨噬细胞胞葬指数最高。
图4c：荧光图像显示BMDMs中EXOs^Tβ4/mPDA@MS组凋亡细胞摄取最多。
图4d：流式细胞术定量显示EXOs^Tβ4/mPDA@MS组CM-Dil阳性BMDMs比例最高。
图4e-f：免疫荧光及定量显示EXOs^Tβ4/mPDA@MS组iNOS表达最低。
图4g-i：Western blot及定量显示EXOs^Tβ4/mPDA@MS组iNOS、IL-18和TNF-α蛋白表达最低。
这些结果表明，EXOs^Tβ4/mPDA@MS显著增强巨噬细胞胞葬作用，同时抑制促炎因子表达。
5. EXOs^Tβ4/mPDA@MS诱导M2巨噬细胞极化并减少胞内ROS
图5a、c：流式细胞术及定量显示EXOs^Tβ4/mPDA@MS组CD206⁺ M2巨噬细胞比例最高。
图5b、d：免疫荧光及定量显示EXOs^Tβ4/mPDA@MS组CD206荧光强度最高。
图5e：流式细胞术显示EXOs^Tβ4/mPDA@MS组细胞内ROS水平最低。
图5f-g：免疫荧光及定量显示EXOs^Tβ4/mPDA@MS组ROS荧光强度最低。
图5h-i：Western blot及定量显示EXOs^Tβ4/mPDA@MS组CD206和Arg-1蛋白表达最高。
这些结果表明，EXOs^Tβ4/mPDA@MS促进巨噬细胞向M2表型极化，并显著降低胞内氧化应激水平。
6. EXOs^Tβ4/mPDA@MS促进糖尿病伤口愈合与再生
图6a-b：STZ诱导糖尿病小鼠伤口照片显示EXOs^Tβ4/mPDA@MS组在各时间点伤口面积最小。
图6c：伤口闭合率定量显示EXOs^Tβ4/mPDA@MS组第14天愈合率最高。
图6d-f：HE染色显示EXOs^Tβ4/mPDA@MS组第7天肉芽组织最厚、炎症水肿最轻、伤口间隙最窄。
图6g-h：HE显示第14天EXOs^Tβ4/mPDA@MS组新生表皮结构完整、真皮排列有序，上皮再生率最高。
图6i-j：Masson染色显示EXOs^Tβ4/mPDA@MS组胶原沉积最丰富且排列整齐。
这些结果表明，EXOs^Tβ4/mPDA@MS显著加速糖尿病伤口愈合，促进上皮再生和有序胶原沉积。
7. EXOs^Tβ4/mPDA@MS编程免疫应答并促进血管生成
图7a-b：免疫荧光（CD68/cleaved caspase-3）及定量显示EXOs^Tβ4/mPDA@MS组胞葬作用指数最高。
图7c-d：免疫荧光显示EXOs^Tβ4/mPDA@MS组IL-1β表达最低。
图7e-f：免疫组化显示EXOs^Tβ4/mPDA@MS组TNF-α密度最低。
图7g-h：免疫荧光（F4/80/CD206）及定量显示EXOs^Tβ4/mPDA@MS组M2巨噬细胞比例最高。
图7i-j：免疫荧光（CD31/α-SMA）及定量显示EXOs^Tβ4/mPDA@MS组血管密度最高。
图7k-l：Western blot及定量显示EXOs^Tβ4/mPDA@MS组CD206和Arg-1蛋白表达最高。
这些结果表明，EXOs^Tβ4/mPDA@MS在体内增强胞葬作用、抑制炎症、促进M2极化和血管新生。
8. EXOs^Tβ4/mPDA@MS通过MerTK/PI3K/Akt信号轴增强巨噬细胞胞葬作用
图8a：聚类热图显示EXOs^Tβ4/mPDA@MS与PBS组间2026个差异表达基因。
图8b：火山图显示1228个基因上调、798个下调，其中MerTK、CD36、C1q显著上调。
图8c：GO富集显示上调基因富集于胞外区、细胞表面、免疫突触及吞噬作用。
图8d：KEGG富集显示显著富集于PI3K/Akt信号、网格蛋白介导内吞和凋亡细胞清除通路。
图8e-f：Western blot及定量显示EXOs^Tβ4/mPDA@MS组MerTK表达最高。
图8g-h：UNC2025（MerTK抑制剂）预处理后，EXOs^Tβ4/mPDA@MS诱导的胞葬作用被显著抑制。
图8i-j：流式细胞术定量证实UNC2025抑制胞葬作用。
图8k-l、n：Western blot显示EXOs^Tβ4/mPDA@MS促进PI3K和Akt磷酸化，UNC2025阻断该效应。
图8m、o-p：体内Western blot显示EXOs^Tβ4/mPDA@MS组MerTK、p-PI3K、p-Akt表达最高。
这些结果表明，EXOs^Tβ4/mPDA@MS通过激活MerTK/PI3K/Akt信号轴增强巨噬细胞胞葬作用。
9. EXOs^Tβ4/mPDA@MS在db/db小鼠中加速伤口愈合
图9a-b：db/db小鼠伤口照片显示EXOs^Tβ4/mPDA@MS组各时间点伤口面积最小。
图9c：伤口闭合率定量显示EXOs^Tβ4/mPDA@MS组愈合最快。
图9d-f：HE染色显示EXOs^Tβ4/mPDA@MS组新生表皮最厚、伤口宽度最窄。
图9g-h：Masson染色显示EXOs^Tβ4/mPDA@MS组胶原最丰富且排列有序。
图9i-j：免疫荧光（CD68/cleaved caspase-3）及定量显示EXOs^Tβ4/mPDA@MS组胞葬指数最高。
这些结果表明，EXOs^Tβ4/mPDA@MS在2型糖尿病db/db小鼠中同样通过增强胞葬作用加速伤口愈合。
结论
研究通过慢病毒转导获得Tβ4过表达的ADSCs，提取富含Tβ4的外泌体；利用微流控技术制备GelMA微载体（~100 μm），并通过mPDA涂层赋予其湿态粘附性和持续释放能力（较未修饰组释放更缓），成功构建了可喷雾、生物粘附的EXOs^Tβ4/mPDA@MS微载体平台，为慢性糖尿病伤口提供了一种喷雾式、可粘附、免疫微环境重编程的工程化外泌体递送新策略。
临床/科研启示
1.“喷雾式”外泌体递送新剂型：EXOs^Tβ4/mPDA@MS以喷雾形式给药，操作便捷、贴合不规则创面，避免了传统敷料更换时的二次损伤，临床依从性高，适合门诊或居家使用。
2.湿态粘附技术解决外泌体流失难题：mPDA涂层赋予微载体在湿润伤口表面的牢固粘附力，有效延长外泌体局部滞留时间，解决了传统水凝胶易被伤口渗出液冲走的核心瓶颈。
3.聚焦胞葬作用的免疫干预新策略：区别于传统抗炎或促血管单一靶点，该研究从“清除凋亡碎片”这一上游环节入手，通过恢复巨噬细胞胞葬功能打破炎症恶性循环，为临床提供了新的治疗逻辑。
4.工程化外泌体“功能增强”策略：Tβ4过表达使外泌体自带免疫调节活性，避免了单纯富集或联合给药的复杂性，为干细胞外泌体的临床功能增强提供了可行路径。
5.胞葬作用作为伤口愈合研究的新热点：通过RNA-seq结合GO/KEGG分析锁定MerTK/PI3K/Akt通路，并利用抑制剂（UNC2025）和siRNA双重验证，为胞葬作用在伤口愈合中的机制研究提供了完整的方法学框架。
