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关键词：钙瞬变信号
研究背景：
急性心肌梗死是全球范围内致死致残的主要原因之一。再灌注治疗虽能挽救缺血心肌，但其本身也会诱发缺血/再灌注（I/R）损伤。此外，化疗药物DOX也可引起急性心肌损伤。目前临床上尚缺乏有效的干预手段。
前列腺素E2（PGE2）及其受体E型前列腺素3受体（EP3）在炎症反应中发挥重要作用。然而，EP3在心脏中的作用长期存在争议：有研究认为EP3激活可减轻心肌损伤，另一些研究则发现EP3过表达会导致心功能减退。更复杂的是，全身性敲除Ep3基因的小鼠在成年后会出现自发性心脏肥大，提示EP3对维持心脏正常结构和功能不可或缺。
那么，能否在不干扰心脏稳态的前提下，通过短期阻断EP3来治疗急性心肌损伤？如果可以，其作用机制是什么？基于此，汕头大学医学院刘斌、周应毕团队联合汕头大学医学院第一附属医院陈业群教授在"Basic Research in Cardiology" 杂志上发表"Short-term blockade of E-prostanoid 3 receptor mitigates necroinflammation and ameliorates ischemia/reperfusion- and doxorubicin-induced acute myocardial injury"文章，文中发现EP3是急性心肌损伤的关键调控靶点，短期阻断该受体可同时作用于免疫细胞和心肌细胞，打破坏死与炎症之间的恶性循环，本研究对此进行了系统探讨。
实验方法：
1.动物模型 全身性Ep3敲除小鼠（Ep3−/−）、髓系细胞条件性Ep3敲除小鼠（Ep3F/F;Lyz2Cre）、他莫昔芬诱导的心肌细胞特异性Ep3敲除小鼠（Ep3F/F;Myh6MerCreMer） 2. 心肌损伤模型 心肌I/R模型（缺血30分钟，再灌注24小时）、DOX急性心肌损伤模型（单次腹腔注射20 mg/kg） 3. 功能评估 超声心动图（EF、FS）、心肌酶谱（CK、CK-MB、LDH）、Evans蓝/TTC双染色评估梗死面积 4. 炎症与细胞死亡检测 流式细胞术（免疫细胞浸润）、ELISA（细胞因子、DAMPs）、Western blot（坏死性凋亡、焦亡、凋亡、自噬、铁死亡标志物）、免疫荧光（细胞定位） 5.细胞钙信号检测 分离成年小鼠心肌细胞，Rhod-2 AM染色，在1 Hz电刺激下记录钙瞬变信号 
实验结果：
1. EP3拮抗剂可减轻I/R诱导的急性心肌损伤 研究者首先在WT小鼠中建立心肌I/R模型，并给予EP3选择性拮抗剂L-798106（分别于缺血开始后15分钟和再灌注后12小时各腹腔注射一次（5 mg/kg，共两次））。结果显示，L-798106治疗组的梗死面积显著缩小，心功能（EF、FS）明显改善，血清心肌酶（CK、CK-MB、LDH）水平也显著降低。 图1 EP3拮抗剂减轻I/R诱导的急性心肌损伤
2. EP3拮抗剂可减轻I/R诱导的促炎细胞浸润 炎症在急性心肌I/R损伤中起着重要作用。近期的工作表明，EP3拮抗剂可减轻急性肾损伤后促炎免疫细胞的浸润。因此，进一步探讨EP3拮抗剂对该过程的影响。流式细胞术显示，L-798106处理后小鼠心脏中白细胞总数和中性粒细胞比例均显著下降，免疫荧光也证实中性粒细胞浸润减少，但巨噬细胞比例未受影响。
图2 EP3拮抗剂减轻I/R诱导的促炎细胞浸润
3. 全身性胚系Ep3缺失未能减轻成年小鼠的心肌I/R损伤 考虑到L-798106可能存在非特异性效应，研究者采用全身性胚系Ep3敲除（Ep3−/−）小鼠。16-18周龄Ep3−/−小鼠出现心脏肥大（ANP、β-MHC升高、心功能受损），而8周龄小鼠无此表型。冠脉血流在基因型间无差异。I/R手术后，Ep3−/−小鼠的梗死面积、心功能和心肌酶均未见改善，表明全身性EP3缺失无保护作用。这可能是因为胚系缺失在8周龄前已启动病理过程，抵消急性期阻断EP3的益处。因此，后续研究采用条件性敲除小鼠。 4. 髓系细胞中EP3的缺失可改善心肌I/R损伤 研究者发现，髓系EP3敲除（Ep3F/F;Lyz2Cre）可减轻急性肾损伤。在心脏I/R模型中，Ep3F/F小鼠髓系细胞的Ep3 mRNA显著上调，而敲除小鼠中检测不到。假手术时两组心功能无差异。I/R后，髓系EP3缺失使梗死面积从35.45%降至16.20%，改善心功能（EF、FS）,并降低血清CK、CK-MB和LDH水平。 
图3 髓系细胞EP3缺失改善心肌I/R损伤
5. 髓系细胞EP3缺失抑制I/R诱导的炎症
研究显示，EP3拮抗剂可减少促炎细胞浸润。I/R损伤后，心脏和血浆中PGI₂和PGE₂水平升高，Ep3 mRNA及上游酶cPLA2、COX-2、mPGES-1、PGIS表达上调，而COX-1不变。同时，心脏中Mcp-1、IL-1β、IL-6、TNF-α的mRNA及蛋白水平显著增加，血清IL-6也升高，DAMPs（HMGB1、S100A8）释放增多。然而，在髓系Ep3条件性敲除小鼠中，上述炎症因子和DAMPs的升高均被显著抑制，中性粒细胞向心脏的浸润也明显减少，表明髓系EP3缺失可有效抑制I/R诱导的炎症反应。
图4 髓系细胞EP3缺失抑制I/R诱导的炎症
6.髓系细胞EP3缺失或EP3拮抗剂可抑制I/R诱导的坏死性凋亡和焦亡
I/R损伤诱导的心肌细胞死亡会不可逆地损害心脏。髓系EP3缺失或EP3拮抗剂可显著抑制I/R诱导的坏死性凋亡（p-RIPK3、p-MLKL）和焦亡（NLRP3、C-caspase-1、GSDMD-N）标志物。免疫荧光证实，EP3拮抗剂减少心肌细胞和内皮细胞中p-MLKL或GSDMD-N阳性细胞的比例。然而，铁死亡（GPX4、GSH、Fe²⁺）、凋亡（C-caspase-3、C-PARP-1）和自噬（LC3B、P62）标志物未受髓系Ep3缺失的影响，表明EP3主要调控坏死性凋亡和焦亡通路。
图5 髓系细胞EP3缺失抑制I/R诱导的坏死性凋亡和焦亡
7. 心肌细胞中EP3的短期敲除可减轻I/R诱导的损伤和炎症
鉴于药物拮抗和髓系EP3缺失可保护心脏（而全身性敲除无效），进一步构建诱导性心肌细胞特异性Ep3敲除小鼠。他莫昔芬诱导1周后，短期敲除可显著减轻I/R损伤：梗死面积减小、心功能改善、心肌酶及炎症因子（IL-1β、IL-6、TNF-α）降低。然而，诱导8周后的长期敲除反而加重损伤，表现为梗死扩大、心功能障碍和心肌酶升高。
图6 心肌细胞上EP3的短期敲除可减轻I/R诱导的损伤和炎症
8. EP3受体激活可增加心肌细胞舒张期Ca²⁺水平
细胞内游离Ca²⁺浓度（[Ca²⁺]i）的异常升高会直接或间接激活细胞死亡通路，并参与I/R损伤。缓解钙超载的干预措施可增强心肌对钙紊乱的抵抗力。由于EP3激活可能改变[Ca²⁺]i，检测EP3激动剂sulprostone（0.01 μM）处理下、1 Hz电刺激的新分离小鼠心肌细胞中的Ca²⁺水平。结果表明，sulprostone可增加舒张期Ca²⁺水平、降低钙瞬变幅度、减慢衰变动力学（CaT90和Tau延长）。Ep3−/−可抑制这些变化。此外，I/R后髓系细胞和心肌细胞均表达Ep3的α、β、γ三种亚型，但心肌细胞中Ep3α表达更高，Ep3β更低，Ep3γ相似。
图7 EP3受体激活可增加心肌细胞舒张期细胞内游离Ca²⁺水平
9.EP3拮抗剂可减轻DOX诱导的急性心肌损伤
急性DOX心肌损伤与I/R机制相似。DOX处理48小时后，小鼠心肌细胞膜完整性丧失（EBD阳性）。EP3拮抗剂L-798106可减轻此改变，改善心功能（EF、FS），并降低血清CK、CK-MB、LDH水平。
图8 EP3拮抗剂减轻DOX诱导的急性心肌损伤
10. 经皮冠状动脉介入治疗（PCI）的患者的炎症和DAMP指标均升高
为评估研究结果的临床相关性，研究者纳入30例急性心肌梗死PCI术后患者和30例匹配健康对照。结果显示，PCI术后患者的血浆PGI2代谢物和PGE2水平显著升高，血清HMGB1、TNF-α和IL-6也明显升高。此外，患者外周血中白细胞、中性粒细胞、单核细胞的绝对计数和百分比均显著增加。
图9 成功接受PCI的患者中，炎症和DAMPs相关参数值均升高
结论：
本研究表明，EP3在心脏中的角色具有高度的时间依赖性——长期（全身性或心肌细胞特异性）EP3缺失会导致心脏功能下降和结构异常，而短期（药物拮抗或诱导性心肌细胞敲除）EP3阻断则可显著减轻缺血/再灌注及DOX诱导的急性心肌损伤。这一发现解释既往关于EP3作用的争议，该研究确立了短期阻断EP3的治疗潜力，并揭示长期缺失的有害性。机制上，EP3通过两条途径驱动“坏死性炎症”的自我放大环路：髓系细胞上促进炎症因子和DAMPs释放，诱导心肌细胞坏死性凋亡与焦亡；心肌细胞上激活后导致舒张期钙超载，直接促进程序性坏死。短期EP3阻断可同时打断这两条通路，这一多靶点策略优于单一抑制某种调节性坏死。临床患者PCI术后同样出现COX通路激活、炎症及DAMP释放升高，支持该策略的转化潜力。
本研究不仅深化对前列腺素受体在心脏中作用的认识，也表明短期阻断EP3是治疗急性心肌损伤的一种有前景的新策略。
