关键词外泌体技术服务、外泌体提取鉴定
黑色素瘤是最具侵袭性的皮肤恶性肿瘤之一，全球发病率正以每年3–7%的速度攀升。尽管PD-1等免疫检查点抑制剂显著改善了晚期患者的预后，但仍有30%–40%的患者对治疗无应答或产生获得性耐药，五年生存率长期徘徊在35%左右。这一困境的核心在于：黑色素瘤细胞并非孤立作战，而是通过与肿瘤微环境的精密对话构建免疫抑制屏障。其中，肿瘤相关巨噬细胞是微环境中数量最丰富的免疫细胞群体，其M2型极化状态与肿瘤进展和转移密切相关。然而，黑色素瘤细胞究竟通过何种分子机制远程"驯化"巨噬细胞向促癌表型转化，这一关键科学问题尚未完全阐明。深入解析肿瘤-巨噬细胞互作的分子桥梁，对于开发新型联合治疗策略、突破现有免疫治疗瓶颈具有重要的临床转化价值。
今天分享的是发表在Cell Death & Disease（IF：9.6）上题为“Melanoma exosomal miR-708-5p promotes macrophage M2 polarization and cancer metastasis”。研究团队针对黑色素瘤免疫治疗应答率低及肿瘤微环境免疫抑制这一关键临床问题，以黑色素瘤外泌体为核心研究对象，通过体外共培养体系与体内移植瘤及肺转移模型验证，阐明黑色素瘤细胞通过RNA结合蛋白SFRS1将具有抑癌活性的miR-708-5p选择性包装入外泌体并分泌至胞外，该外泌体将miR-708-5p传递至肿瘤相关巨噬细胞并靶向抑制FOXN3，进而激活PI3K/AKT/mTOR信号通路驱动巨噬细胞M2型极化，促进免疫抑制性细胞因子IL-10和TGF-β分泌，最终加速黑色素瘤增殖、侵袭与肺转移，为逆转肿瘤免疫抑制微环境及开发miR-708-5p/FOXN3靶向治疗策略提供了全新的分子机制与干预靶点。
研究思路
1.聚焦科学问题，锁定核心研究主线
黑色素瘤恶性程度高、易早期转移，现有PD-1免疫检查点抑制剂存在30%–40%患者耐药、预后差难题；肿瘤相关巨噬细胞TAMs介导的免疫抑制微环境是黑色素瘤进展转移关键，但黑色素瘤外泌体调控巨噬细胞极化的具体分子机制尚未阐明，以此为切入点开展机制挖掘。
2.筛选关键分子，锁定核心调控因子
通过miRNA测序对比黑色素瘤外泌体处理前后巨噬细胞差异表达miRNA，筛选出miR-708-5p为显著高表达核心分子；进一步验证发现该 miRNA 依赖SFRS1蛋白分选，特异性富集在黑色素瘤外泌体中，成为细胞间通讯关键载体。
3.解析双向功能，揭示miRNA双重作用
明确miR-708-5p存在细胞特异性双重功能：在黑色素瘤细胞内发挥抑癌作用，抑制肿瘤增殖、侵袭并诱导凋亡；肿瘤细胞通过SFRS1将其分选包装进外泌体分泌胞外，规避自身抑制效应，重塑肿瘤微环境。
4.挖掘下游通路，阐明分子调控机制
巨噬细胞摄取外泌体miR-708-5p后，直接靶向抑制FOXN3基因，进而激活PI3K/AKT/mTOR信号通路；下调FOXN3会促使巨噬细胞向M2型极化，降低巨噬细胞吞噬能力，上调IL-10、TGF-β免疫抑制因子分泌，形成免疫抑制微环境。
5.体内外联动，验证促癌表型效应
通过细胞共培养、Transwell、EdU增殖等体外实验，以及裸鼠皮下成瘤、肺转移活体成像等体内模型，证实M2极化的巨噬细胞可显著促进黑色素瘤增殖、侵袭、EMT进程及肺部转移。
6.靶向价值落地，奠定临床转化潜力
证实miR-708-5p与FOXN3可作为黑色素瘤早期诊断生物标志物和潜在治疗靶点；为研发靶向外泌体miR-708-5p、调控巨噬细胞极化的新型干预策略，破解黑色素瘤转移与免疫治疗耐药提供全新理论依据。
研究结果
1.黑色素瘤细胞来源外泌体诱导巨噬细胞M2极化
图1A：实验设计示意图，展示了Transwell共培养体系。
图1B：流式细胞术检测结果显示，与正常人类表皮黑色素细胞（HEMa）组相比，与A375细胞共培养显著提高了THP-1巨噬细胞（THP-1 (Mφ)）中CD206⁺细胞的比例；而经GW4869预处理后，CD206⁺比例显著降低。
图1C：qRT-PCR分析表明，与A375共培养后，THP-1 (Mφ)中M2型标志物（Arg1、CD206、IL-10、TGF-β）的mRNA水平显著上调，而M1型标志物（NOS2、TNF-α）的表达无明显变化；GW4869处理则显著抑制了M2标志物的上调。
图1D：免疫荧光染色显示，CFSE标记的A375来源外泌体可被鬼笔环肽标记的THP-1 (Mφ)有效内吞。
图1E：流式细胞术显示，与PBS组相比，A375来源外泌体处理24小时后，THP-1 (Mφ)中PE-CD206⁺细胞比例显著升高，而APC-CD86表达水平无显著差异。
图 1F：qRT-PCR结果显示，A375来源外泌体处理可显著上调THP-1 (Mφ)中M2型标志物的mRNA表达，并显著下调M1型标志物的表达。
图 1G：免疫荧光实验证实，CFSE标记的A375来源外泌体同样可被鬼笔环肽标记的PBMC来源巨噬细胞有效摄取。
图 1H：流式细胞术结果显示，与PBS组相比，A375来源外泌体处理后的PBMC来源巨噬细胞中CD163⁺细胞比例显著增加。
图 1I：qRT-PCR结果显示，A375来源外泌体处理显著上调PBMC来源巨噬细胞中M2型标志物，并下调M1型标志物的mRNA水平。
这些结果表明黑色素瘤来源的外泌体可以有效促进巨噬细胞的M2极化。
2.黑色素瘤外泌体miR-708-5p介导巨噬细胞M2极化
图2A-B：火山图和热图展示，经A375细胞来源外泌体处理的THP-1巨噬细胞中，表达上调或下调最显著的12个miRNA。
图2C：流式细胞术结果显示，在THP-1巨噬细胞中过表达上述6个上调的miRNA时，仅miR-708-5p过表达可显著上调CD206⁺巨噬细胞比例。
图2D：qRT-PCR分析显示，miR-708-5p富集于含有外泌体的A375细胞条件培养基中，而通过超速离心去除外泌体后，其水平显著下降。
图2E：qRT-PCR结果显示，与PBS对照组相比，A375来源外泌体处理后THP-1 (Mφ)和PBMC来源巨噬细胞中miR-708-5p的水平均显著升高。
图2F：qRT-PCR结果显示，外泌体处理并未改变THP-1 (Mφ) 细胞中miR-708-5p的前体（pri-miR-708-5p和pre-miR-708-5p）水平。
图 2G：免疫荧光染色结果显示，GW4869处理显著降低了THP-1 (Mφ)细胞对Cy3标记的miR-708-5p的内吞作用。
图2H：qRT-PCR结果显示，与miR-NC组相比，miR-708-5p模拟物转染显著上调THP-1 (Mφ)细胞中M2标志物并下调M1标志物；而共转染miR-708-5p抑制剂则可逆转此效应。
图2I：流式细胞术检测进一步证实，与miR-NC组相比，miR-708-5p模拟物可显著提高THP-1 (Mφ)细胞中CD206阳性比例，而该效应可被miR-708-5p 抑制剂有效抑制。
图2J：qRT-PCR结果显示，与miR-NC组相比，miR-708-5p模拟物转染显著上调PBMC来源巨噬细胞中M2标志物并下调M1标志物；而共转染miR-708-5p抑制剂则可逆转此效应。
图2K：流式细胞术检测进一步证实，与miR-NC组相比，miR-708-5p模拟物可显著提高PBMC 来源的巨噬细胞中CD206阳性比例，而该效应可被miR-708-5p 抑制剂有效抑制。
这些结果表明黑色素瘤来源外泌体富含miR-708-5p，可被巨噬细胞内化并促进其M2极化。
3. miR-708-5p通过SFRS1包装到外泌体中
图3A：通过RBPDB和RBPsuite数据库对miR-708-5p结合蛋白进行生物信息学预测，SFRS1 被鉴定为参与其外泌体分选的潜在候选蛋白。
图3B：qRT-PCR结果显示，与si-NC组相比，si-SFRS1-1和si-SFRS1-2均能显著降低A375细胞中SFRS1的mRNA表达水平。
图3C：Western blot结果显示，与si-NC组相比，si-SFRS1-1和si-SFRS1-2处理组中SFRS1蛋白表达减弱。
图3D：qRT-PCR结果显示，在敲低SFRS1的A375细胞中，细胞内miR-708-5p的水平显著累积。
图3E：qRT-PCR结果显示，与细胞内积累相反，SFRS1敲降后A375细胞来源外泌体中miR-708-5p的相对水平显著降低。
图3F-G：免疫荧光分析表明，敲低A375细胞内SFRS1后，THP-1（Mφ）细胞对Cy3标记的miR-708-5p的内吞作用显著降低。
图3H：RIP实验结果证实，与IgG对照组相比，SFRS1抗体组中miR-708-5p的相对富集程度显著升高，证实SFRS1与miR-708-5p在细胞内存在特异性结合.
图3I：miRNA下拉实验表明，miR-708-5p可特异性结合SFRS1；当miR-708-5p的预测结合序列（AGGA）发生突变时，该结合作用消失。
这些结果表明SFRS1与miR-708-5p结合，并介导其分选到黑色素瘤外泌体中进行分泌。
4.用黑色素瘤外泌体治疗或在巨噬细胞中表达 miR-708-5p 可促进黑色素瘤的进展和转移
图4A-B：Transwell实验显示，与PBS-M组相比，无论是否进行GW4869处理，经外泌体孵育或miR-708-5p转染后，黑色素瘤细胞的侵袭和迁移能力均增强。
图4C-D：EdU增殖实验结果表明，与PBS-M组相比，无论是否进行GW4869处理，经外泌体孵育或miR-708-5p转染后，黑色素瘤细胞的增殖速率显著提高。
图4E：Western blot结果显示，与PBS组相比，预先用外泌体处理的巨噬细胞上清液处理的A375细胞中上皮-间质转化（EMT）标志蛋白（MMP7、Vimentin和N-Cadherin）的表达水平显著升高。
图4F：Western blot结果显示，与miR-NC组相比，表达miR-708-5p的巨噬细胞上清液处理的A375细胞中EMT标志蛋白的表达水平显著升高。
图4G‑H：裸鼠皮下成瘤实验表明，与A375和A375+PBS-M相比，A375+Exo-M能显著促进肿瘤生长。
图4I-J：裸鼠皮下成瘤实验表明，与A375和A375+M-NC相比，A375+M-miR-708-5p能显著促进肿瘤生长。
图4K：体内生物发光成像显示，在经CL清除内源性巨噬细胞的裸鼠中，与PBS-M组相比，Exo-M组和miR-708-M组显著促进小鼠肺转移。
图4L：Ki67免疫组化和H&E染色结果显示，在经CL清除内源性巨噬细胞的裸鼠中，与PBS-M组相比，Exo-M组和miR-708-M组的裸鼠肺转移灶的数量与大小显著增加。
这些结果表明经黑色素瘤来源外泌体处理或过表达miR-708-5p的极化巨噬细胞能够促进体外黑色素瘤细胞的迁移、侵袭和增殖。
5.鉴定FOXN3为miR-708-5p的直接靶标以及FOXN3的作用
图5A：韦恩图显示，miRWalk、mirDIP、miRDB三个数据库共同预测的交集靶基因共34个，并列出排名前十的候选靶基因。
图5B：qRT-PCR检测显示，在THP-1 (Mφ)中转染miR-708-5p模拟物后，RHO、ADGRL1、RAP1B和FOXN3的mRNA水平均出现下调，其中FOXN3下调最为显著。
图5C：序列分析显示，在FOXN3 mRNA的3‘非翻译区（3’-UTR）中存在一个与miR-708-5p互补的假定结合位点。
图5D：双荧光素酶报告基因实验证实，在转染含野生型FOXN3 3’‑UTR报告质粒的细胞中，miR‑708‑5p 可显著降低荧光素酶活性；而转染携带突变型FOXN3 3'‑UTR的报告质粒时，未观察到明显变化。
图5E：qRT-PCR和Western blot结果显示，与PBS对照组相比，外泌体处理后THP-1 (Mφ)中FOXN3的mRNA和蛋白水平显著下调。
图5F：qRT-PCR和Western blot结果显示，与PBS对照组相比，外泌体处理后PBMC来源巨噬细胞中FOXN3的mRNA和蛋白水平均显著降低。
图5G：qRT-PCR和Western blot结果显示，与miR-NC组相比，miR-708-5p模拟物转染后THP-1 (Mφ)中FOXN3的mRNA和蛋白水平均显著下调。
图5H：qRT-PCR和Western blot结果显示，与miR-NC组相比，miR-708-5p模拟物转染后PBMC来源巨噬细胞中FOXN3的mRNA和蛋白水平均显著降低。
图5I：流式细胞术分析显示，与si-NC组相比，si-FOXN3转染后THP-1 (Mφ)中PE-CD206⁺细胞比例显著升高。
图5J-K：qRT-PCR结果显示，在THP-1 (Mφ)或PBMC来源的巨噬细胞中敲低FOXN3，能上调M2型标志物并下调M1型标志物的mRNA水平。
图5L：Transwell实验表明，与FOXN3敲低的巨噬细胞共培养，可显著促进黑色素瘤细胞的侵袭和迁移能力。
图5M：EdU增殖实验表明，转染了si-FOXN3的THP-1 (Mφ)细胞上清液处理A375细胞中EdU阳性细胞比例显著高于si-NC-M组。
这些结果表明miR-708-5p直接靶向巨噬细胞中的FOXN3，且FOXN3在调控巨噬细胞极化和功能中发挥关键作用，miR-708-5p对其的下调促进巨噬细胞向促肿瘤的M2表型转化，从而促进黑色素瘤的进展。
6. FOXN3缺陷通过上调PI3K/AKT信号通路促进巨噬细胞向M2表型极化
图6A：qRT-PCR结果显示，与对照组相比，转染miR-708-5p模拟物的THP-1 (Mφ)细胞中M2型巨噬细胞标志物的表达显著升高，而M1型巨噬细胞标志物的表达降低。
图6B：流式细胞术分析证实，与对照组相比，miR-708-5p模拟物转染后THP-1 (Mφ)中PE-CD206⁺细胞比例显著升高；而共表达flag-FOXN3后，CD206⁺比例降低。
图6C：Transwell实验表明，与A375+Control-M组相比，A375+miR-708-5p-M组中A375细胞的侵袭和迁移细胞数显著增加；而A375+miR-708-5p+FOXN3-M组中侵袭和迁移细胞数显著减少。
图6D：EdU增殖实验表明，与转染了miR-708-5p的THP-1 (Mφ)共培养的 A375 细胞增殖增加，而当巨噬细胞中重新表达 FOXN3 时，这种增殖显著减弱。
图6E：Western blot检测显示，与PBS对照相比，A375来源外泌体处理后THP-1 (Mφ)和PBMC来源巨噬细胞中PI3K、AKT和mTOR的磷酸化水平均显著升高。
图6F：Western blot检测显示，与对照组相比，miR-708-5p模拟物转染后THP-1 (Mφ)和PBMC来源巨噬细胞中p-PI3K、p-AKT和p-mTOR水平均显著升高；而共表达flag-FOXN3后，上述磷酸化蛋白水平均显著回落。
图6G：Transwell实验显示，与A375+Control-M组相比，转染miR‑708‑5p模拟物的巨噬细胞可增强A375细胞的侵袭和迁移能力，而PI3K‑AKT信号通路抑制剂LY294002可逆转该效应。
图6H：EdU增殖实验表明，与A375+Control-M组相比，转染miR‑708‑5p模拟物的巨噬细胞可增强A375细胞的增殖能力，而LY294002处理可逆转该效应。
图6I：ELISA检测显示，与Control组相比，si-FOXN3或miR-708-5p模拟物转染的永生化骨髓来源巨噬细胞（iBMDMs）中TGF-β分泌显著增加，而促TNF-α分泌显著降低；共表达flag-FOXN3后，上述细胞因子分泌异常均被恢复至接近对照水平。
这些结果表明miR-708-5p通过靶向FOXN3并激活PI3K/AKT通路促进巨噬细胞向M2极化。
结论
这项研究揭示了黑色素瘤外泌体中富集的miR-708-5p通过靶向巨噬细胞中的FOXN3并激活PI3K/AKT/mTOR信号通路，驱动巨噬细胞向M2型极化，进而促进黑色素瘤的增殖、侵袭、迁移和肺转移。研究同时发现miR-708-5p在黑色素瘤细胞内具有抑癌作用，其通过RNA结合蛋白SFRS1被选择性包装进入外泌体并分泌至肿瘤微环境，实现了肿瘤细胞"自我保护"与"微环境重塑"的双重功能。该发现不仅阐明了黑色素瘤与肿瘤相关巨噬细胞互作的新机制，也为黑色素瘤的早期诊断和靶向治疗提供了新的潜在标志物和治疗策略，例如通过工程化外泌体装载miR-708-5p抑制剂来重编程巨噬细胞表型，恢复抗肿瘤免疫活性。
