免疫检查点抑制剂（ICI）是肿瘤治疗的重要手段，但临床响应率不足50%，其常用标志物肿瘤突变负荷（TMB）因新生抗原鉴定不全而准确性有限。传统方法依赖全外显子测序和短读长RNA-seq，主要覆盖编码区突变，难以发现非编码区、异常剪接等来源的抗原，且多为生物信息学预测，真实呈递的抗原验证率低。此外，T细胞激活依赖于HLA-I/II呈递的新生抗原，但目前对其完整谱系仍缺乏全面认知。 文章解析 研究成果展示 ▶ 发表时间：2026年1月27日 ▶ 期刊：Cell Reports (IF=6.9) ▶ 文章标题： Immunopeptidomics combined with full-length transcriptomics uncovers diverse neoantigens ▶ 核心内容： 该研究通过将全长转录组测序与免疫肽组学相结合，对黑色素瘤样本进行了蛋白质组学层面的新抗原鉴定。研究发现，传统依赖于全外显子测序的方法难以检测到足够的新抗原，而该新策略成功发现了大量此前被忽视的“隐秘”新抗原，包括源自非编码区、翻译移码及上游开放阅读框的肽段。研究进一步通过功能实验验证了多个肿瘤特异性T细胞受体与这些新抗原的对应关系。该成果揭示了肿瘤新抗原的多样性远超预期，并为开发更精准的癌症免疫治疗靶点提供了新的技术路径。 1、研究方法 本研究选取了4例黑色素瘤患者，并成功建立配对的自体癌细胞系（MEL02、MEL03、MEL04、MELC3）和肿瘤浸润淋巴细胞系，先通过scRNA/TCR-seq对4种癌细胞系的DNA突变进行全外显子测序，再用免疫沉淀-质谱分析直接检测HLA-I和HLA-II呈递的肽段，作为对照验证传统方法的局限性，随后通过Iso-Seq（PacBio SMRT全长转录组）+IP-MS（免疫肽组学）鉴定HLA-I/II呈递的肽段，最后通过NFAT荧光素酶报告实验、串联小基因筛选验证新生抗原与TCR的配对关系。 图:本研究的主要研究过程 2、研究结果 1. 传统方法（WES+IP-MS）的局限性 研究发现MEL04细胞系具有高TMB，但WES预测的新生抗原负荷与肿瘤特异性CD8+T细胞克隆型数量无显著相关性（R值无明显关联），证实TMB无法充分反映真实的新生抗原谱。IP-MS检测4例样本的HLA-I呈递肽，平均鉴定出4638条肽段，9聚体肽为主要长度，但结合WES仅筛选出1个突变来源的新生抗原，证实传统方法覆盖度极低，表明绝大多数被呈递的肽段并非来自常规的外显子突变(图1)。 图1. 四例黑色素瘤患者的WES和IP-MS结果及新抗原鉴定 2. Iso-Seq全长转录组挖掘出大量新型可编码转录本 为了验证WES未覆盖的非外显子区域是否被转录为异常转录本，并翻译为新抗原。作者对4例黑色素瘤细胞系进行Iso-Seq测序，平均鉴定出70707条全长度转录本，其中32%为新型转录本（未在参考基因组注释），包括新剪接连接（21%）和全新剪接位点/基因间转录本（6.3%），所有转录本中84%被预测可编码蛋白质(图2)，这说明肿瘤细胞中存在着大量未被注释的新型转录本可能产生新的抗原。 图2. Iso-seq(长读长测序技术)检测的新型转录本 3. Iso-Seq+IP-MS联合鉴定出大量非常规来源的隐蔽肽 为了探究可能来源于长读长RNA测序检测到的转录本的肽段，作者构建Iso-Seq转录本的三阅读框翻译肽库，结合IP-MS检测的HLA-I/II呈递肽，筛选出未收录于UniProt数据库的隐蔽肽（cryptic peptides）（图3A），四例样本共检测到16951条HLAI型肽段，平均7.1%（共1197条）被归类为隐秘肽段，对隐秘肽段的基因组来源分析显示隐秘肽段的来源极其多样，大多数来自非编码区、移码翻译，且91%（984/1087）的隐秘肽段是单个患者特有的，表现出高度个性化特征，这些在公共数据库难以发现（图3B）。通过IP-MS对HLA-II结合肽段鉴定，从两个样本（MEL02和MEL04）共检测到8856条HLA-II呈递肽段，平均6.5%（共577条）被归类为隐秘肽段，主要来自非编码区和翻译移码事件（图3D）. 图3.免疫肽组学结合全长转录组学检测到的HLA-I/HLA-II呈递的隐秘肽段 4. HLA-I呈递的隐蔽肽可作为新抗原 为了验证检测到的HLA-I/II呈递隐蔽肽是否能够诱导癌症特异性CD8+T细胞的免疫应答（图4A），作者采用串联小基因筛选+NFAT荧光素酶报告实验，对MEL04的肿瘤特异性CD8+/CD4+T的激活反应进行了分级筛选，最终从141条HLAI型隐蔽肽中筛选出3个功能性新生抗原，成功验证3组CD8+TCR-新生抗原配对（TCR#1-No.41，MTFPATWTGAK、TCR#4-No.53，LQIPWKLLK、TCR#9-No.58，KILEGITLILK），其中2个抗原在多个样本中共享（图4B-D）。从83条HLAII型隐蔽肽中筛选出1个功能性新生抗原，成功验证1组CD4+TCR-新生抗原配对（TCR#16-No.7，FLPINLLLIHFDRL）。 图4.肿瘤特异性CD8⁺TCR对HLA-I呈递的隐秘肽段的反应 3、研究结论
本研究通过将全长转录组测序（Iso-seq）与免疫肽组学（IP-MS）相结合，突破了对参考基因组注释的依赖，大幅提升了真实呈递的新生抗原的检出数量与多样性。在四例黑色素瘤患者中，传统依赖全外显子测序的方法仅鉴定出极少量新抗原，且预测数量与实际肿瘤特异性T细胞数量无相关性；而新方法成功鉴定出上千条未收录于UniProt数据库的“隐秘肽段”，这些肽段主要来源于非编码区、翻译移码及上游/下游开放阅读框等传统方法无法覆盖的区域，并通过功能实验证实其能被肿瘤特异性CD8⁺和CD4⁺T细胞识别。研究结论表明，该联合分析策略不仅有助于个体化新抗原的发现，也为挖掘未知隐蔽肽、开发更精准的肿瘤疫苗提供了重要的技术路径。
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