TCR‑T免疫治疗可识别MHC‑I呈递的胞内肿瘤抗原，是实体瘤治疗的重要方向。但肿瘤特异性TCR筛选仍面临关键瓶颈：肿瘤异质性强、新抗原个体化差异大，特异性T细胞占比极低且易耗竭；传统筛选方法依赖体外扩增与四聚体分选，流程繁琐、成本高、通量低。HLA高度多态性也增加了表位与HLA亚型匹配难度。单细胞测序虽能直接获取TCR序列，却缺少高效转化的一体化技术体系。因此，建立基于单细胞测序、快速低成本、可同步筛选TCR、表位及HLA亚型的整合系统，对推动TCR‑T临床转化至关重要。 研究成果展示 ▶ 发表时间：2025年7月 ▶ 期刊：J Immunother Cancer (JITC，IF 10.6) ▶ 文章标题：Integrated system for screening tumor-specific TCRs, epitopes, and HLA subtypes using single-cell sequencing data ▶ 核心内容：中国医学科学院苏州系统医学研究所张为国团队在《J Immunother Cancer》发表该研究论文，系统的报道了一套肿瘤特异性TCR、表位及HLA亚型的一体化筛选系统。该系统通过优化TCR快速组装方法，结合HLA敲除抗原呈递细胞与NFAT‑GFP报告细胞，实现了高灵敏的功能性TCR筛选。应用该系统从宫颈癌数据中成功鉴定出识别HLA‑B*15:18呈递的HPV16‑E7特异性TCR，且改造后的TCR‑T细胞可有效杀伤HPV阳性肿瘤细胞，为实体瘤免疫治疗提供了高效且可扩展的技术方案。百蓁生物（Baizhen Biotechnologies）为本研究提供了免疫肽质谱检测与分析服务。 1、研究方法 本研究先从HPV16阳性宫颈癌单细胞测序数据中挖掘肿瘤反应性 CD8+ T 细胞的 TCR 序列与患者 HLA 分型；通过CDR3 快速组装法低成本、快速构建 TCR 文库；同时构建HLA 敲除293T抗原呈递细胞与Jurkat NFAT-GFP 报告细胞，完成抗原反应性 TCR 的高通量筛选；再经表位预测、截短与丙氨酸扫描定位候选肽，最后通过免疫肽组学鉴定天然呈递表位，明确靶表位与限制性 HLA，并验证 TCR-T 的体外肿瘤杀伤功能，形成高效、标准化的 TCR 筛选体系。 2、研究结果 1.高效的肿瘤新抗原特异性TCR筛选系统 通过CRISPR/Cas9依次敲除Jurkat细胞的内源性TCR和CD4基因，导入CD8αβ与NFAT-GFP报告基因，构建JTR细胞系。同时构建HLA-I全敲除HEK-293T细胞用于重建患者特异性HLA。验证显示该系统可检测1:10,000比例的TCR阳性细胞，敏感性极高。TNF-α和IFN-γ处理可上调免疫蛋白酶体亚基LMP2和LMP7，显著增强抗原呈递能力，为高通量筛选奠定基础。 图1. 肿瘤特异性 TCR 筛选平台的建立 2. 批量克隆大量 TCR 的新方法建立 开发模块化TCR克隆策略：预合成49种TRAV、56种TRAJ、52种TRBV和13种TRBJ片段，以mCherry为填充序列，通过Bbs I位点标准化克隆CDR3区域，T2A肽连接α/β链。每个TCR仅需两对CDR3引物，2天内完成克隆，5-10个TCR混合为亚文库。该方法成本低廉、可扩展至数百个TCR，大幅优于全长基因合成策略。 图2. 肿瘤来源 TCR 全长 α 链和 β 链的组装 3. HPV16 E6/E7 特异性 TCR 的筛选 分析HPV16宫颈癌scRNA-seq数据，基于耗竭标志物定义肿瘤反应性CD8⁺ T细胞，以克隆频率>10筛选73个候选TCR构建10个亚文库。功能性筛选发现亚文库#2与HLA-B*15:18/E6E7 APC共培养时诱导2% GFP表达。单克隆筛选确定TCR2-3为HPV特异性TCR，其TCR-T细胞对SiHa宫颈癌细胞表现出强效杀伤活性。 图3. 利用本研究 TCR 筛选平台进行 HPV 特异性 TCR 的筛选 4. HLA 限制性抗原表位分析 通过netMHCcons预测和脉冲实验，确定TCR2-3识别HPV16-E7的8-mer肽MHGDTPTL（EC₅₀=29.87 nM），而非完整11-mer。丙氨酸扫描揭示P2-His、P4-Asp、P6-Pro、P7-Thr和P8-Leu为关键残基，P4和P7分别与CDR3α/β相互作用。质谱直接从HLA-B*15:18鉴定到该肽，但其未被netMHCcons预测，揭示算法局限性，同时明确该HLA偏好P2为His、C端为疏水残基。 图4. HLA-B*15:18 呈递的 HPV 抗原表位分析 3、研究结论
本研究建立整合抗原呈递、模块化TCR组装和NFAT-GFP报告细胞的筛选平台，从HPV16⁺宫颈癌单细胞数据中鉴定出TCR2-3，特异性识别HLA-B*15:18呈递的8-mer肽MHGDTPTL（HPV16 E7）。质谱直接验证该表位，揭示netMHCcons预测局限性。TCR-T细胞对宫颈癌细胞具强效杀伤活性。该平台可2周内筛选数百个TCR，为实体瘤TCR-T免疫治疗提供高效低成本方案。
