肠神经系统（Enteric nervous system，ENS）被称为“第二大脑”，由分布于胃肠道中的神经元和胶质细胞组成，负责调控肠道蠕动、黏膜分泌及营养吸收，是维持胃肠功能稳态的重要基础。ENS发育主要经历肠神经嵴来源细胞（Enteric neural crest-derived cells，ENCCs）的迁移、定植以及随后神经元分化成熟等关键过程，其中神经元成熟决定了神经节形成及功能性神经环路的建立。一旦这一过程受损，可能导致肠神经系统发育异常疾病，如低神经节细胞症（Hypoganglionosis，HG）。HG患者通常表现为肌间神经丛密度降低、神经元数量减少及成熟障碍，但其具体致病机制仍不明确。近年来研究发现，神经突起生长是神经元成熟过程中不可缺少的环节，而自噬作为维持神经发育稳态的重要质量控制机制，已被证实参与中枢和外周神经发育，但其在ENS形成中的作用仍知之甚少。因此，解析调控肠神经元成熟及神经突起形成的关键机制，将有助于深入理解HG等ENS疾病的发生并寻找新的干预靶点。
2026年6月23日，华中科技大学同济医学院附属同济医院冯杰雄教授研究团队在国际知名期刊PNAS上发表了题为“The EMB/ATG7-mediated autophagic process regulates neurite outgrowth and promotes enteric neuronal development”的研究成果。
本研究聚焦肠神经系统发育过程中神经元成熟障碍，首次揭示跨膜糖蛋白EMB是调控肠神经元成熟的重要因子。研究发现，HG患者肠组织中EMB表达显著下降；构建Emb敲低小鼠后，可重现神经元密度下降、成熟受阻及结肠运动异常等HG样表型。机制上，EMB通过与自噬蛋白ATG7相互作用，促进其募集至自噬体膜并驱动自噬体形成，从而维持自噬过程正常进行；EMB缺失则导致自噬受阻，抑制神经突起生长并最终影响肠神经元成熟。该研究为理解ENS发育异常及HG发生提供了新的机制基础和潜在治疗方向。
为明确EMB在ENS发育中的作用，研究首先在一个HG家系中通过全外显子测序鉴定到EMB致病性突变（exon 6.692A>G，p.D231G）。组织分析显示，EMB主要表达于肠神经元，在HG患者结肠组织中其表达明显下降。结合单细胞数据进一步发现，EMB在胚胎期肠神经元中高表达，出生后逐渐下降，提示其可能参与肠神经成熟过程。为验证其功能，研究利用piggyBac技术构建Emb敲低小鼠。Emb KD小鼠虽整体发育正常，但出现明显结肠粪便潴留，并伴随肌间神经丛稀疏、神经元密度下降及神经节间距增大等典型HG样改变，同时结肠慢波频率及振幅异常，提示肠道运动功能受损。这些结果表明，EMB缺失可导致肠神经发育障碍并诱导HG样病理改变。 图1 EMB缺失诱导肠神经发育异常并形成HG样表型·研究结果·
1、EMB缺失导致肠神经发育异常并诱导HG样表型
由于HG的重要特征之一是神经元成熟不足，研究进一步关注神经突生长与突触形成过程。结果显示，在Emb KD小鼠中，多个发育阶段均出现突触形成标志物SYP和SNAP25减少，同时TUJ1阳性神经突面积下降，提示神经元成熟及神经纤维延伸受损。进一步在E14.5来源原代肠神经球分化体系中验证发现，EMB缺失导致成熟神经元比例下降、神经突数量减少，并伴随神经纤维成熟度下降及生长锥形态异常。这些结果说明EMB是促进神经突生长和肠神经元成熟的重要调控因子。 图2 EMB促进神经突生长并驱动肠神经元成熟2、EMB通过促进神经突起生长驱动肠神经元成熟
为解析其机制，研究分选WT与Emb KD小鼠肠神经元开展Smart-seq2测序。结果发现，EMB缺失引起广泛转录重塑，差异基因显著富集于神经发育及自噬相关通路，包括神经突延伸、自噬体形成及突触调控等过程。通过透射电子显微镜（TEM）观察发现Emb KD小鼠肠神经元内自噬体分布异常，而自噬相关蛋白BECN1与LC3B表达降低。这些结果提示，EMB可能通过调控自噬过程维持肠神经元成熟。 图3 EMB通过调控自噬维持肠神经元成熟过程3、EMB缺失抑制自噬并影响肠
为寻找连接EMB与自噬的关键分子，研究采用免疫共沉淀联合质谱筛选候选互作蛋白，并结合AlphaFold3进行结构预测。结果发现，EMB与核心自噬蛋白ATG7存在潜在结合关系；进一步实验表明，EMB通过胞外Ig-V样结构域与ATG7发生特异性相互作用。 为了在活细胞内验证这一互作过程，研究利用课题组建立的BiFC双分子荧光互补体系进行验证。 研究分别将绿色荧光蛋白（GFP）拆分为两个无荧光片段，并分别融合至EMB和ATG7蛋白。当两者在细胞内形成复合体时，分离的GFP片段重新组装并恢复荧光信号，从而实现蛋白互作的可视化追踪。 结果显示，EMB不仅能够形成同源二聚体，还可与ATG7产生明显荧光互作信号。进一步联合自噬体标志物LC3B及溶酶体标志物LAMP1进行共定位分析，发现EMB–ATG7复合体定位于自噬体及自噬溶酶体相关结构。 上述结果不仅验证了EMB与ATG7在活细胞中的直接互作关系，也提示EMB可能通过募集ATG7参与自噬体形成早期过程，从而促进后续自噬活动发生。 图4 EMB通过结合ATG7参与自噬调控机制4、EMB通过与ATG7相互作用调控自噬过程
为验证EMB功能，研究利用慢病毒构建EMB敲低的Neuro-2a稳定细胞株，并转染EMB–EGFP进行回补实验。结果显示，EMB过表达可显著促进神经突延长。随后利用维甲酸诱导神经分化，利用雷帕霉素激活自噬，发现两种处理均可增加形成神经突的细胞比例，并促进神经突数量和长度增加，提示自噬激活有助于神经突生长及神经元成熟。进一步分析发现，EMB缺失并不影响ATG7总蛋白表达，但会阻碍ATG7形成点状聚集并降低其与LC3B共定位，从而削弱自噬体形成。氯喹阻断实验证实，EMB缺失导致LC3B-II累积减少、自噬通量下降。这些结果说明EMB通过募集ATG7至自噬体膜激活自噬，促进自噬体形成并增强自噬活性，从而促进神经突生长。 图5 EMB募集ATG7激活自噬并促进神经突延伸5、EMB通过募集ATG7激活自噬并促进神经突生长
在明确EMB通过募集ATG7激活自噬后，研究进一步在人胚胎干细胞（hESCs）来源的神经分化体系中验证上述机制。研究采用慢病毒构建EMB和ATG7敲低的hESCs稳定细胞株，并诱导其向神经嵴细胞及神经元方向分化。结果显示，敲低EMB或ATG7并不影响干细胞多能性维持，但显著降低神经嵴细胞形成效率及成熟神经元比例，导致更多细胞停留于未成熟神经状态。使用雷帕霉素处理后，神经元比例及神经突长度均得到部分恢复。这些结果说明，EMB–ATG7依赖性自噬是促进神经突生长和驱动肠神经元成熟的重要机制。 图6 EMB–ATG7依赖性自噬促进肠神经元成熟6、EMB/ATG7介导的自噬促进神经突生长并驱动肠神经元成熟
既往研究已发现EMB参与肠神经嵴来源细胞迁移，而本研究进一步揭示EMB在肠神经元成熟过程中同样具有关键调控作用。研究发现，EMB通过募集ATG7至自噬体膜促进自噬体形成，从而驱动后续自噬过程并支持神经突生长与神经元成熟。该研究突破了传统将自噬视为细胞稳态维持机制的认知，提出自噬参与肠神经系统发育程序调控的新观点，并首次将EMB介导的自噬异常与HG发生联系起来，为理解ENS发育障碍及相关肠动力疾病提供了新的机制基础和潜在干预靶点。
·结论·
和元生物有幸为研究者提供pLenti-shRNA-EMB慢病毒，LC3B自噬双标慢病毒和BIFC质粒，以实际行动助力基础研究！和元助力
