密歇根大学Jason R. Spence团队完成并于2025年7月发布于bioRxiv，题为Mapping mesenchymal diversity in the developing human intestine and organoids，首次将单细胞转录组（scRNA-seq）与原位空间转录组（10X Xenium）深度整合，构建了跨越人类小肠胚胎发育至成年阶段的间质细胞高分辨率空间图谱，并以此为标准对多能干细胞衍生小肠类器官（HIO）的体内移植模型（tHIO）进行了系统性评估，填补了领域内空白。研究者采用石蜡包埋的tHIO样本完成了高质量的Xenium分析，证明类器官在移植后能重建与体内高度相似的间质空间拓扑结构（如亚上皮层、固有层、黏膜下层的分层排布）。这一突破打破了传统认知，确立了类器官可作为Xenium等空间组学的可靠样本来源，为以类器官为模型开展发育机制解析、疾病建模及药物筛选提供了高精度的空间基准范式。
研究思路
研究结果
1.人胎儿小肠全景空间转录组图谱的构建与平台校验
本研究的首要突破在于克服了传统单细胞测序技术的固有局限，构建了高分辨率的人胎儿小肠空间转录组参考数据集。研究团队首先整合了公共数据库中涵盖受孕后5至21周的人类胎儿小肠scRNA-seq数据，从中筛选出能够精确区分上皮、间质、平滑肌、内皮、肠神经系统（ENS）及免疫细胞的所有关键标志基因及信号通路分子，最终设计了一款包含292个基因的Xenium定制化探针面板。利用该面板，研究者对7例不同发育阶段（54–142天受孕后，DPC）的人胎儿小肠FFPE样本进行了原位空间转录组测序。数据分析显示，与scRNA-seq因组织解离造成的细胞比例偏差不同，Xenium技术完美保留了组织的原位细胞构成。例如，上皮细胞在Xenium数据中稳定占总细胞数的30.3%–36.5%，远高于scRNA-seq中的11.4%–18.1%；而平滑肌与免疫细胞的比例在不同样本中表现更为稳定，纠正了解离过程引入的技术假象。尤为重要的是，该技术准确捕捉到了肌黏膜层（Muscularis Mucosa）在80–105 DPC期间开始出现的关键发育事件，与经典的组织学发育时间窗高度吻合。这一成果不仅建立了一个细胞分辨率级别的胎儿小肠空间图谱，更为后续精细解析间质成纤维细胞的异质性奠定了坚实的结构与分子基础。
2.发育期小肠非平滑肌成纤维细胞的转录与空间异质性界定
在全景图谱的基础上，研究深入聚焦于长期被视作“黑箱”的肠道间质，对其进行了精细的转录与空间异质性解析。研究人员从合并后的scRNA-seq数据中提取出所有VIM⁺/COL1A1⁺/THY1⁺的间质细胞，并通过生物信息学方法严格剔除了已分化的平滑肌细胞（ACTA2⁺/TAGLN⁺）、周细胞（RGS5⁺）、Cajal间质细胞（KIT⁺）以及正在活跃分裂的增殖细胞。剩余的成纤维细胞群体经过降维聚类分析，被清晰地界定为四个转录特征迥异的亚群。这四类亚群分别是：1）上皮下细胞（SEC），高表达PDGFRA与F3（组织因子）；2）固有层成纤维细胞（LPF），特征基因为FABP5、ADAMDEC1及GPX3；3）黏膜下成纤维细胞（SMF），特异性表达SHISA3、FIBIN及C1QTNF3；4）CXCL13⁺成纤维细胞，特异性高表达趋化因子CXCL13。随后的Xenium原位数据证实，这四类亚群并非批次效应或解离伪影，而是真实存在于组织中，并具有独特的空间分布模式。这一发现彻底推翻了既往将肠道间质视为单一PDGFRA⁺成纤维群体的笼统认知，首次在人类中建立了成纤维细胞的分子-空间分类体系。
3. 成纤维细胞亚型的时空定位与发育动态标志演化
研究进一步揭示了上述四类成纤维细胞亚型在发育过程中的时空动态演化规律。通过Xenium成像结合独立的RNAscope荧光原位杂交（FISH）验证，各亚型的空间锚定性和分子标志物转换得到了精确描绘。SEC（F3⁺）最早于54 DPC即在绒毛上皮下方形成连续单层，并沿隐窝-绒毛轴延伸，早期虽在上皮有微弱表达，但80 DPC后成为其专属标志。LPF（FABP5⁺/ADAMDEC1⁺）位于SEC下方，填充绒毛轴心，并表现出显著的时序性分子转换：早孕期以FABP5⁺ADAMDEC1⁻为主，提示其为未成熟或祖细胞状态；80 DPC起两者共表达；发育晚期则呈现FABP5衰减、ADAMDEC1⁺增强的趋势，表明LPF经历了一个由不成熟向成熟状态转变的分化轨迹。SMF（SHISA3⁺）定位于肌黏膜与外环肌之间的黏膜下层，早期呈松散多层，随着发育推进被挤压为致密的黏膜下带。CXCL13⁺成纤维细胞直至101 DPC后才出现，数量稀少，多嵌于隐窝颈部SEC层或其紧邻区域，与肠道相关淋巴组织（GALT）的发生区域重合，强烈提示其在免疫微环境形成中的潜在功能。这些发现为判断组织及类器官的间质成熟度提供了关键的分子时钟。
4. 移植人小肠类器官（tHIO）主要细胞构成的全局评估
利用上述建立的空间转录组资源，研究团队对两种经典人多能干细胞（hiPSC）来源的小肠类器官模型进行了系统性评估。他们将表皮生长因子（EGF）诱导组和Epiregulin（EREG）诱导组的小肠类器官移植至免疫缺陷小鼠的肾包膜下，使其在体内成熟10周（即transplanted HIO, tHIO），随后进行Xenium分析。结果显示，两类tHIO均能成功实现多谱系的细胞组装，包含上皮、成纤维细胞、内皮细胞、肠神经系统（ENS）以及分层的平滑肌结构（包括外纵肌、内环肌及发育良好的肌黏膜层），这与体内胎儿小肠的组成高度相似，缺失的是人类源性免疫细胞，符合该类模型的已知特性。在细胞比例上，tHIO的成纤维细胞占比略低于胎儿小肠，而平滑肌细胞占比偏高，且EGF与EREG两组在整体细胞构成上并无显著差异。在形态学上，tHIO展现出了惊人的自组装能力，形成了具备多管腔的单元结构，每个单元均包含上皮、间质、肌层等近似体内的分层架构。这部分结果证明，tHIO能够大体再现人体小肠的复杂组织结构，是进行发育生物学研究的可靠模型。
5.tHIO中间质微环境的亚型组成与空间保真度解析
尽管tHIO在宏观上模拟了肠道结构，但对其间质微环境的精细解析揭示了更深层次的差异。研究发现，tHIO基本再现了体内三大主要成纤维亚群的空间排布：SEC贴附于上皮基底侧，LPF填充于绒毛轴心，SMF分布于黏膜下层。然而，关键的缺陷在于CXCL13⁺成纤维细胞在tHIO中完全缺失，这与tHIO整体偏早期胎儿阶段的发育状态相符。在诱导方案上，两者也显示出细微差别：EGF诱导的tHIO上皮仍异常表达F3，且LPF偏向FABP5⁺ADAMDEC1⁻的早期表型；而EREG诱导的tHIO上皮F3基本沉默，LPF更多呈现ADAMDEC1⁺的成熟表型，表明EREG诱导在促进间质与上皮协同成熟方面更具优势。此外，研究还发现了一小群“未定义”的成纤维细胞，它们仅表达泛间质标记（VIM/COL1A1），却不表达任何亚型特异性标记，散在分布于类器官外周或肌层间隙，可能是培养体系中产生的异位分化或去分化细胞。这一部分的发现具有里程碑意义：它证明了对类器官的评价不能止步于“有无某种细胞”，必须纳入空间拓扑与阶段特异性基因表达谱的考量，本研究建立的图谱为此提供了可量化的基准。
6. 成纤维细胞分型在成人十二指肠中的保守性与比例重塑
为了验证发育期定义的分类体系是否适用于成年组织，研究将该Xenium探针面板应用于一位44岁女性的全层十二指肠样本。结果证实，所有四种成纤维亚型在成人组织中均被检出，且空间定位与胎儿期高度保守，证明了该分类框架的长期有效性。然而，细胞比例发生了显著的生理性重塑：SEC占成纤维细胞的比例与胎儿期相近，但LPF激增至64.67%，成为成人肠壁最主导的间质成分；与之相反，SMF的比例则大幅下降至16.20%，由胎儿期的致密带变为稀疏散布；CXCL13⁺细胞依旧罕见。同时，成人样本中的免疫细胞比例较胎儿期大幅升高，反映了成年肠道丰富的淋巴组织环境。这一重塑现象揭示了间质功能的动态转换：在发育早期，SMF的丰富可能有助于组织的塑形与扩张；而在成年期，LPF的扩增则与营养吸收支持及更为复杂的免疫屏障维护功能密切相关。这为理解间质在生命周期中的功能演变提供了重要线索。
7.间质谱系发育轨迹与类器官工程启示的综合模型
在完成了对上述六大类群的定义与验证后，研究进一步整合所有数据，提出了关于人类小肠间质发育与稳态的综合模型（即Figure 7）。该模型系统梳理了从胚胎中胚层起源开始，间质细胞逐步分化为四大成纤维谱系（SEC、LPF、SMF、CXCL13⁺）的完整轨迹。模型明确指出，每种亚型都占据着特定的解剖生态位：SEC构成上皮下的“保护鞘”，LPF填充绒毛核心以支持营养交换，SMF构成黏膜下的支撑层，而CXCL13⁺成纤维细胞则在隐窝颈部这一免疫活跃区发挥特化功能。更为重要的是，该模型将tHIO的评估结果直观地映射到了发育轴上，揭示了当前类器官模型虽然能够复现基本的空间层级，但在分子成熟度上仍滞后于对应发育阶段的胎儿组织，特别是缺乏代表晚期功能的CXCL13⁺亚群。这一综合模型不仅为理解先天性肠病（如由于间质信号缺失导致的绒毛发育不全）提供了细胞学基础，更为下一代类器官工程指明了优化方向——未来的工作不应仅追求细胞种类的多样性，而应致力于通过精确调控生长因子梯度、细胞外基质硬度及免疫微环境，迫使成纤维细胞亚群在正确的空间位置上达到正确的分子成熟度，从而实现从“形似”到“神似”的跨越。
研究思路
本研究构建了第一个横跨发育与成年的人类小肠间质细胞空间分辨图谱，确立了SEC、LPF、SMF及CXCL13⁺成纤维细胞的分子标记与解剖学定位，揭示了LPF的标志基因切换（FABP5→ADAMDEC1/GPX3）及CXCL13⁺晚现等关键发育动力学规律。更重要的是，该研究提供了一种全新的“空间基准线”评价体系，证明下一代肠道类器官工程不仅需要关注细胞类型的多样性，更需严格把控细胞的空间秩序与成熟状态。这一资源将为未来解析先天性肠道畸形（如先天性巨结肠、短肠综合征）及炎症性肠病的发病机制，以及指导工程化肠道组织的精准构建提供不可或缺的理论依据与参照标准，实现了从转录图谱向三维组织坐标系统的转化，强调了“正确的细胞必须在正确的位置”这一发育与再生的基本原则。同时也为后期类器官样本用于Xenium 等空间组实验提供了指导和理论依据。
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