单细胞转录组学（scRNA-seq）与 CRISPR 筛选技术的结合（即 Perturb-seq），改变了我们解析基因功能的方式。然而，在真实的活体组织环境中，如何高效、大规模地研究基因的功能获得（Gain-of-Function, GOF）效应，存在着诸多技术难题。 最近，一篇发表在《Science》上的研究“Mapping transcription factor functions in astrocytes using in vivo gain-of-function Perturb-seq” ，为我们展示了一种全新的策略——iGOF-Perturb-seq（体内功能获得型 Perturb-seq）。研究团队利用这一平台，在活体小鼠大脑中成功构建了包含近千个转录因子（TFs）的星形胶质细胞功能图谱，不仅揭示了生理状态下的基因调控网络，更在疾病模型中成功筛选出潜在的治疗靶点。 今天，我们将带您深入解析这篇文献，重点了解其最核心的体内筛选技术（iGOF-Perturb-seq）是如何设计和实施的。 在介绍具体技术之前，我们先来理清两个概念： 体外细胞培养虽然简单，但无法模拟活体组织中复杂的微环境（如血脑屏障、免疫细胞浸润、细胞间通讯）。星形胶质细胞的功能高度依赖于其所处的微环境，脱离了大脑，很多研究结果的临床相关性会大打折扣。 目前主流的体内 CRISPR 筛选多集中于基因敲除（Loss-of-Function, LOF） 。然而，在癌症或神经退行性疾病中，基因的过表达往往是病理过程的关键驱动因素。此外，筛选具有保护作用的治疗靶点通常也需要GOF策略。 研究团队面临的最大挑战是如何在有限的动物模型和细胞数量下，保证庞大文库中每个基因都能被充分代表，且不产生过高的假阳性。他们通过以下几个关键步骤，成功构建了iGOF-Perturb-seq 平台： 01 高保真文库的设计与构建 精简目标定制文库：考虑到 AAV 的包装极限，研究人员没有选择全基因组，而是精心挑选了约 1200 个长度小于2kb的小鼠转录因子（TF）开放阅读框（ORF）。 Barcode一一对应：为每个TF ORF分配了一个独1无2的16bp条形码（Barcode） 。 质量控制：组装完成后，使用PacBio长读长测序技术对质粒文库进行验证，确保条形码与TF的匹配准确率超过80%，最终确认了1089个高质量的TF。 病毒质粒骨架设计及质粒匹配准确率质控 02 精准的体内递送与 MOI 控制 跨越血脑屏障精准靶向：研究采用了AAV-PHP.eB衣壳变体。这种变体能通过简单的眶后静脉注射（Retro-orbital injection）穿透血脑屏障，高效感染全脑细胞。 细胞特异性表达：在 AAV 载体中，使用了星形胶质细胞特异性的短片段 GFAP 启动子（sGFAP），并串联了ZsGreen 绿色荧光蛋白用于后续细胞分选。 控制感染复数（MOI）：这是体内筛选成败的关键！如果一个细胞感染了多个病毒（MOI > 1），就无法确定是哪个基因导致了表型变化。研究团队通过预实验严格滴定了病毒剂量，确定了2.5×10¹¹vg/只的注射量，使得全脑约10%的星形胶质细胞被感染，从而在数据分析阶段能够最大限度地筛选出MOI=1的单细胞数据。 细胞靶向特异性验证 03 单细胞测序与条形码的定向扩增 细胞采集：病毒注射3周后，解离小鼠脑组织，利用流式细胞术（FACS）分选出表达 ZsGreen 的星形胶质细胞。 10x单细胞测序与定向捕捉：在传统的单细胞测序中，外源基因的检测效率往往很低。为了确保能准确读出每个细胞感染了哪个TF，研究人员在10x Genomics 的全转录组扩增（WTA）阶段后，设计了特异性引物，定向扩增 TF 的条形码和细胞条形码。 数据匹配：将测得的细胞转录组信息与定向扩增的 TF 条形码进行匹配。只有明确检测到单一TF条形码（即 MOI=1）的细胞，才会被纳入最终的分析。 基因长度与丢失率监控及单细胞测序数据初探 03 解析基因调控图谱，筛选并验证疾病有效靶点 研究成果：从图谱构建到疾病治疗通过上述严谨的方法，研究团队获得了超过13万个高质量的星形胶质细胞单细胞图谱。 利用非负矩阵分解（cNMF）技术 ，研究人员识别出了5个协同发挥作用的TF模块（如调控细胞身份、免疫反应等）。这不仅验证了已知TF的功能，更成功预测了诸如Maff和Lef1等此前未被充分研究的TF在星形胶质细胞中的作用。 这也是该研究最激动人心的部分。研究人员利用前期的分析结果，挑选了39个可能与神经退行性疾病相关的TF，构建了一个子文库。他们将这个子文库注射到小鼠体内，并用LPS（脂多糖）诱导神经炎症模拟病理状态。通过在病理环境下的二次筛选，他们发现过表达转录因子 Ferd3l 能够显著抑制神经毒性星形胶质细胞的激活。 在5XFAD 阿尔茨海默病小鼠模型中，全脑星形胶质细胞特异性过表达Ferd3l，不仅抑制了炎症反应，还显著缓解了小鼠的认知缺陷，证明了iGOF-Perturb-seq在筛选治疗靶点方面的巨大潜力。 04 高通量筛选驱动新药靶点挖掘，全流程方案赋能科研攻坚 《Science》的这项研究不仅仅是为星形胶质细胞绘制了一张详尽的转录因子图谱，更重要的是，它为复杂活体组织内的大规模基因功能研究提供了一套完整的解决方案。 iGOF-Perturb-seq平台的灵活性意味着它不仅可以用于转录因子，还可以扩展到其他蛋白质家族甚至非编码RNA。可以预见，随着病毒递送技术和单细胞测序成本的进一步优化，体内高通量筛选必将成为解码复杂疾病机制和发现新药靶点的核心驱动力。 看完《Science》的重磅研究，您是否也想在自己的研究领域（如肿瘤、代谢、神经）开展体内高通量筛选？艾菱菲致力于将最前沿的CRISPR体内文库筛选技术的开发和应用。提供从靶点预测、文库定制、高效递送到复杂动物模型验证的体内筛选解决方案。欢迎后台留言或联系我们，探讨您的下一个Breakthrough！ 江苏艾菱菲生物科技有限公司（Jiangsu Aniphe Biolaboratory Inc.）建成了集动物代繁代养、疾病模型构建、动物实验于一体的，涵盖肿瘤、神经、代谢等领域的综合性SPF实验动物中心。 中心含大小鼠笼位5000笼以上凭借专业的技术团队以及丰富的动物资源艾菱菲生物可提供多种疾病动物模型，如大小鼠脑缺血再灌注模型MACO/R、心肌梗死/心肌缺血MI、主动脉弓缩窄TAC、人源组织异种移植肿瘤模型PDX、细胞移植肿瘤模型CDX、脊髓损伤模型SCI、癫痫动物模型Epilepsy、阿尔兹海默病 AD模型等，并针对相关疾病模型进行药理药效等服务，欢迎广大客户前来咨询！
严控质量的合成与组装：为了避免 PCR 扩增带来的嵌合体错配，研究人员直接合成了带有同源臂的TF ORF，采用无缝克隆技术将其插入到AAV质粒骨架中。 
