当前，CAR-T细胞疗法在血液肿瘤中已取得突破性疗效，但在实体瘤（尤其是肺癌）中却困境重重：肿瘤浸润效率不足、T细胞持续性耗竭、以及免疫抑制微环境的多重压制，导致客观缓解率不足10%。如何同步实现肿瘤靶向递送、逆转T细胞耗竭并重塑免疫微环境，成为该领域亟待解决的核心难题。外泌体作为天然纳米载体，凭借其低免疫原性、可工程化修饰及固有生物活性，为突破这些瓶颈提供了全新思路。
今天分享的是一篇发表在【J Nanobiotechnology.】（IF：12.6）上题为“Engineering BiTE-inspired IPSC-exosomes to potentiate CAR-T cell therapy against lung cancer”的研究，该研究开发了一种可吸入的工程化诱导多能干细胞（iPSC）来源外泌体平台（BIEXO@IPA），该外泌体表面展示抗PD-1/间皮素（MSLN）双特异性单链可变片段（scFv），并负载IPA。该平台通过雾化吸入实现肺部高效递送，同时利用iPSC外泌体的固有抗肿瘤特性、双特异性桥接PD-1⁺T细胞与MSLN⁺肿瘤细胞、以及IPA介导的代谢重编程（扩增Tpex细胞），协同增强CAR-T细胞在肺癌模型中的抗肿瘤疗效。
研究思路
1.明确关键障碍
CAR-T疗法在实体瘤（如肺癌）中面临T细胞浸润差、耗竭及免疫抑制微环境等核心瓶颈，响应率低于10%。现有联合策略（如PD-1抗体、BiTE）存在半衰期短、Treg招募、制造复杂等问题。
2.设计多功能外泌体平台
利用iPSC来源外泌体（IEXO）的高产、固有抗肿瘤特性及可工程化优势，通过慢病毒转导使其表面展示抗PD-1/MSLN双特异性scFv（BiTE结构），并电穿孔负载IPA，构建可吸入的BIEXO@IPA纳米平台。
3.验证材料性能
表征外泌体形貌（TEM）、粒径（NTA）、zeta电位、标志物（Western blot），确认scFv成功展示（ELISA定量约732个/外泌体）及7天内稳定性（>90%）；确认IPA电穿孔载药效率及缓释曲线（50h释放约70%）。
4.验证细胞桥接与靶向递送能力
ELISA和流式证实BIEXO同时结合PD-1和MSLN；FRET和共聚焦显示BIEXO桥接PD-1⁺T细胞与MSLN⁺肿瘤细胞。雾化吸入后，BIEXO@IPA肺部积聚较静脉注射提高>10倍，肿瘤细胞特异性摄取达79.3%，而脂质体仅47.9%。
5.体外验证免疫调节与抗肿瘤功能
BIEXO防止PD-L1诱导的T细胞耗竭；BIEXO@IPA通过AhR通路扩增TCF-1⁺Tpex细胞（可被AhR拮抗剂阻断）；在TIL共培养模型中，BIEXO@IPA增强肿瘤细胞杀伤。
6.体内评估抗肿瘤疗效与微环境重塑
在原位肺癌模型中，雾化BIEXO@IPA使肿瘤负荷减少87.9%，80天生存率80%（BIEXO单药40%）。机制上，增加CD8⁺T细胞浸润和功能（IFN-γ⁺、TNF-α⁺），扩增Tpex，减少Treg。
7.联合CAR-T增强疗效及免疫记忆
BIEXO@IPA联合CAR-T实现66.7%完全缓解、100%生存（80天），优于CAR-T+抗PD-1（33.3%）。CAR-T细胞扩增、持久性和效应功能增强；完全缓解小鼠再挑战时83.3%抵抗肿瘤生长，效应记忆T细胞扩增。在肺转移模型和PDX人源化模型中得到验证。
8.安全性评估
全身毒性、血生化、血常规、主要器官HE染色及血清肿瘤标志物均无异常，证明生物相容性。
研究成果
1. BIEXO@IPA平台的工程化与表征
图1A：示意图展示scFv构建体在iPSC上表达的设计，包含抗PD-1和抗MSLN scFv，通过PDGFR跨膜域锚定于外泌体表面。
图1B-C：透射电镜（TEM）显示工程化外泌体呈典型杯状形态，粒径30–150 nm；NTA分析确认粒径分布。
图1D：Western blot检测外泌体标志物（CD9、HSP70、TSG101）阳性，Calnexin阴性，表明高纯度。
图1E：Zeta电位测量显示工程化外泌体带负电（-20至-30 mV）。
图1F：Western blot检测His标签标记的scFv，证实成功展示于外泌体表面。
图1G：免疫荧光染色进一步确认BIEXO表面His标签阳性。
图1H-I：稳定性评估显示BIEXO在含10%血清的缓冲液中孵育7天后，粒径和表面scFv表达保留>90%。
图1J：IPA定量标准曲线。
图1K：不同浓度IPA的包封效率与载药量，100 µg/mL为最佳平衡点。
图1L：体外释放曲线显示IPA在37°C生理温度下50 h内累计释放约70%，呈缓释特征。
这些结果表明，成功构建了表面展示双特异性scFv、负载IPA的稳定iPSC来源外泌体（BIEXO@IPA），具有良好的理化性质和缓释能力。
2.细胞桥接与抗肿瘤活性增强
图2A-B：ELISA显示BIEXO以浓度依赖性方式结合PD-1和MSLN受体。
图2C-D：流式细胞术验证BIEXO特异性结合PD-1⁺T细胞和LLC-MSLN肿瘤细胞，信号强度比对照高>10倍。
图2E-F：共聚焦显微镜确认BIEXO优先结合靶细胞。
图2G-H：显微镜及FRET分析显示BIEXO有效桥接PD-1⁺T细胞与LLC-MSLN细胞，呈剂量依赖性增强细胞间近距离接触。
图2I-J：功能实验显示BIEXO可防止PD-L1介导的T细胞耗竭，维持与抗PD-1抗体相当的细胞毒性。
图2K-L：BIEXO@IPA处理组中，PD-1⁺CD8⁺T细胞内TCF-1⁺比例显著增加，该效应被AhR拮抗剂CH-223,191消除，表明BIEXO@IPA通过AhR通路维持T细胞干性。
图2M：CCK8显示IEXO、MIEXO、BIEXO均抑制LLC-MSLN增殖，BIEXO效果最强。
图2N：在模拟肿瘤微环境（TIL+肿瘤细胞）中，BIEXO诱导的细胞毒性显著强于PIEXO或MIEXO，联合IPA后进一步增强。
这些结果表明，BIEXO具有双特异性桥接、阻断PD-1/PD-L1以及增强T细胞杀伤的功能，IPA通过AhR通路促进Tpex细胞扩增，协同增强抗肿瘤免疫。
3.雾化BIEXO@IPA的肺部递送与生物分布
图3A-D：静脉注射导致外泌体主要积聚于肝脏，而雾化吸入后肺部荧光信号显著增强。
图3E-F：剂量递增实验显示，12.5–100 µg范围内肺内积累呈线性关系。
图3G：流式细胞术显示，给药24 h后，BIEXO@IPA、IEXO@IPA和Lipo@IPA在总肺细胞中的阳性率分别为31.33%、26.75%和16.08%。
图3H-J：肿瘤细胞特异性摄取分析显示，BIEXO@IPA在LLC细胞中的内化比例高达79.33%，显著高于IEXO@IPA和Lipo@IPA。
图3K-N：不同细胞群体的摄取分布：BIEXO@IPA在巨噬细胞（F4/80⁺CD11b⁺）、上皮细胞和树突状细胞中的摄取均低于Lipo@IPA，表明其肿瘤细胞特异性更强。
这些结果表明，雾化吸入可实现高效的肺部靶向递送，双特异性修饰进一步增强了外泌体对肿瘤细胞的特异性摄取。
4. BIEXO@IPA在原位肺癌模型中的治疗疗效及肿瘤微环境分析
图4A：实验设计示意图。
图4B-C：IVIS生物发光成像显示，与PBS对照组相比，BIEXO单药组肿瘤负荷减少49.1%，BIEXO@IPA组减少87.9%。
图4D：肺体积测量，BIEXO@IPA组肺体积最小。
图4E：Kaplan-Meier生存曲线显示，BIEXO@IPA组80天生存率达80%，BIEXO组为40%，PIEXO和MIEXO中位生存期约49–50天，IPA和PBS组仅为32和29天。
图4F-G：流式细胞术显示BIEXO@IPA组瘤内CD8⁺T细胞比例显著升高。
图4H-I：免疫荧光证实BIEXO@IPA组CD8⁺T细胞浸润增加。
图4J：BIEXO@IPA组中PD-1⁺CD8⁺T细胞内TCF-1⁺比例显著高于BIEXO组，提示IPA增强Tpex细胞。
图4K-M：BIEXO@IPA组CD4⁺T细胞尤其是Treg细胞比例显著降低。
图4N-R：NK细胞、树突状细胞和巨噬细胞数量在各组间无显著差异。
这些结果表明，BIEXO@IPA显著抑制原位肺癌进展、延长生存期，其机制主要为增强CD8⁺T细胞浸润与功能、扩增Tpex细胞并减少Treg细胞。
5. BIEXO@IPA的生物安全性评估
图5A：12周内小鼠体重监测显示各组间无显著差异。
图5B-F：血清生化指标（ALP、ALT、AST、BUN、Cr）均处于正常范围。
图5G-I：血常规指标（WBC、RBC、PLT）未见治疗相关改变。
图5J：主要器官（心、肝、脾、肺、肾）HE染色未见明显病理损伤。
图5K-O：血清肿瘤标志物（AFP、CEA、MUC1、CA125、CA19-9）水平与PBS对照组无差异，排除致瘤风险。
这些结果表明，BIEXO@APA具有良好的生物相容性和安全性，无系统毒性及致瘤性。
6. BIEXO@IPA增强CAR-T细胞在肺癌模型中的抗肿瘤疗效
图6A-B：荧光显微镜和流式细胞术确认mCherry标记的CAR-T细胞成功构建，CAR表达率约70%。
图6C：联合治疗实验设计示意图。
图6D-E：IVIS成像显示，CAR-T单药组肿瘤负荷中度抑制，CAR-T+aPD-1组改善，而CAR-T+BIEXO@IPA组实现66.7%完全缓解。
图6F：生存曲线显示，CAR-T+BIEXO@IPA组80天生存率100%，CAR-T+aPD-1组为33.3%，CAR-T单药组为16.7%，PBS组为0%。
图6G：瘤内CD8⁺T细胞比例：CAR-T+BIEXO@IPA组为42.9%，CAR-T+aPD-1组为33.3%，CAR-T单药组为21.4%。
图6H：Treg细胞比例：CAR-T+BIEXO@IPA组降低75%，CAR-T+aPD-1组降低54%。
图6I：CAR-T细胞内TCF-1中位荧光强度：CAR-T+BIEXO@IPA组提升2.3倍，优于aPD-1组合。
图6J：免疫荧光显示BIEXO@IPA组CAR-T细胞最深穿透肿瘤实质。
图6K：外周血CAR-T细胞动力学：BIEXO@IPA组在第14天峰值达10.7%（总T细胞），较单药组提高3.6倍。
图6L-M：瘤内CAR-T细胞中IFN-γ⁺和TNF-α⁺比例在BIEXO@IPA组显著升高。
图6N-O：肿瘤再挑战实验：完全缓解小鼠于第110天再次接种肿瘤细胞，83.3%抵抗肿瘤生长，而对照组全部成瘤。
图6P-Q：记忆T细胞分析显示，BIEXO@IPA组效应记忆T细胞（CD44⁺CD62L⁻）扩增，幼稚T细胞减少。
图6R-U：B16F10-MSLN肺转移模型中，CAR-T+BIEXO@IPA组转移结节减少93%，肺重和肿瘤细胞计数均显著优于其他组。
这些结果表明，BIEXO@IPA联合CAR-T治疗可显著增强抗肿瘤疗效、诱导持久免疫记忆，效果优于传统PD-1抗体联合方案。
结论
该研究构建了表面展示抗PD-1/MSLN双特异性scFv并负载IPA的iPSC外泌体（BIEXO@IPA）。雾化吸入后，外泌体自身抗肿瘤、双特异性桥接T细胞与肿瘤并阻断PD-1/PD-L1、IPA经AhR通路扩增Tpex细胞，协同增效；联合CAR-T使肿瘤负荷减少87.9%，80天生存率100%，83.3%小鼠抵抗再挑战，且无系统毒性。
