整合 7 大数据集、192 例食管鳞癌患者，筛选44 万高质量单细胞，覆盖早中晚不同肿瘤分期，全景解析 TME 细胞组分变化

采用 10x Visium HD 超高分辨率空间转录组，分析2 例免疫治疗响应 / 耐药患者治疗前后配对组织，从空间原位定位细胞互作

纳入 7 例接受 PD-1+化疗的患者样本，通过 mIHC、H&E 染色验证分子互作

利用 TCGA、IMvigor210 队列，从生存预后、泛癌层面验证胆固醇代谢与免疫耐药的关联

为解析食管鳞癌肿瘤微环境重塑特征，整合 7 套公共单细胞数据集，包含 32 例正常食管组织及 I 期 36 例、II 期 52 例、III 期 69 例、IVA 期 3 例食管鳞癌样本。经严格质控后保留约 44 万个高质量单细胞，基于经典标志物注释出 9 种主要细胞类型。组间对比显示：相较于 I/II 期，III/IV 期食管鳞癌组织中 B 细胞比例减少，IV 期同时伴随 T 细胞与髓系细胞数量下降。值得注意的是，免疫治疗后对比发现：耐药患者中 T 细胞、髓系细胞比例升高，而 B 细胞显著减少。

Activated B cells高表达 CD80、CD86、TNFRSF13B（TACI）等关键活化与共刺激分子，呈现功能活化表型；同时高表达VIM、S100A 家族及骨架结构蛋白，提示该群细胞处于迁移过渡状态。CXCR4 中等表达、BCL6 低表达，提示该群细胞为pre-germinal center (pre-GC) B 细胞，拟时序轨迹分析也印证了这一结论。综上结果证实：GC细胞功能异常是食管鳞癌进展及免疫治疗耐药中 B 细胞抗肿瘤免疫受损的核心原因。

图1 食管鳞状细胞癌细胞的单细胞RNA图谱

共分离出 14.5 万个上皮细胞，inferCNV 分析筛选恶性细胞。对 82191 个恶性细胞进行 NMF 分析，最终鉴定出 14 个功能模块。值得注意的是，胆固醇代谢富集的恶性细胞随食管鳞进展持续存在，并在免疫治疗耐药患者治疗后显著富集。

进一步解析了胆固醇重编程全过程，包括摄取、外排、储存及从头合成。胆固醇合成关键基因，如MSMO1、DHCR7、MVD、INSIG1、IDI1、CYP51A1、HMGCR、HMGCS1、HSD17B7、TM7SF2、FDFT1、FDPS、CES1、MVK、SC5D、LSS、DHCR24、G6PD、SREBF2、ACLY、SQLE、ACAT2，在高胆固醇代谢肿瘤细胞中显著上调。该细胞亚群转录特征与不良临床预后显著相关。TCGA 食管鳞癌队列显示，胆固醇合成评分越高，患者总生存期、无进展生存期越短。单个胆固醇合成基因（如 HSD17B7）高表达提示预后不良。IMvigor210 队列证实，胆固醇合成特征在免疫治疗疾病进展患者中显著升高，提示其是跨癌种的免疫耐药共性特征。

图2 ESCC中上皮恶性细胞的功能分析

利用 10x Visium HD 空间转录组分析 2 例患者治疗前后的配对组织。高分辨率细胞反卷积显示：治疗应答者肿瘤中胆固醇合成细胞减少、浆细胞浸润增加。耐药患者治疗后胆固醇合成肿瘤细胞仍维持高水平，浆细胞减少，肿瘤边缘GC B 细胞富集的三级淋巴结构明显扩张。耐药患者治疗后肿瘤 TLS 评分更高，且集中分布于GC B 细胞区域，说明并非 TLS 数量，而是 TLS 功能异质性决定免疫治疗疗效。

图3 ESCC患者经免疫治疗后的空间转录组图谱

在胆固醇代谢微环境中，耐药患者治疗后GC B 细胞显著增多，但浆细胞生成受阻，提示GC B 细胞分化功能受损。空间可视化结果证实，耐药患者治疗后组织中胆固醇合成肿瘤细胞与GC B 细胞高度共定位，且共定位区域 TLS 评分显著升高。CellChat 细胞通讯分析筛选出MIF-CXCR4是GC B cells 和cholesterol biosynthesis-related cells的关键配体受体对。空间转录组也进一步验证：耐药患者组织中 MIF 与 CXCR4 共定位程度更高。此外，MIF 高表达于胆固醇合成型恶性细胞，其限速酶 HMGCR 也同步上调。巨噬细胞极少分布于生发中心区域，排除巨噬细胞来源 MIF 主导耐药的可能性。

图4 高分辨率空间转录组中胆固醇生物合成相关生态位分析

治疗应答者肿瘤微环境富含 CD83⁺/CD86⁺抗原呈递细胞，未见明显 MIF-CXCR4 异常互作。相比之下，耐药患者中GC B细胞（CXCR4hiCD83loCD86lo dark-zone亚组）与胆固醇生物合成肿瘤细胞（pan-CK+HMGCRhi）之间表现出持续的MIF-CXCR4串扰。H&E染色及空间转录组学进一步验证了GC B与TLS/GC区域内胆固醇合成相关肿瘤细胞之间的相互作用。

图5 MIF+肿瘤细胞驱动GC B细胞功能受损

mIHC进一步证实肿瘤细胞浸润于TLS/GC区域。值得注意的是，耐药患者的基线治疗前肿瘤已表现出低频MIF-CXCR4相互作用，暗示治疗前可能存在早期GC功能障碍。空间转录组显示，含有 MIF 阳性肿瘤细胞的 TLS 区域大量富集耗竭型 T 细胞（CD3⁺PD-1⁺TIM-3⁺）与耗竭 B 细胞（CD20⁺CD21⁻CD27⁻），造成免疫抑制。这些结果共同揭示：肿瘤分泌的 MIF 竞争性结合 CXCR4，抢占 CXCL12 天然配体结合位点，阻断GC B 细胞成熟与浆细胞分化，最终诱发食管鳞癌免疫治疗耐药。

图6 MIF+肿瘤细胞与B细胞免疫反应受损有关