【题目】Nanopore long-read RNA sequencing of human monocytes reveals
activation-induced alternative splicing toward functional isoforms
【发表期刊】Nature Communications
【发表时间】2026年5月29日
【IF】18.2
一、研究背景
可变剪接是拓展转录组与蛋白质组多样性的核心转录后调控机制，在单核细胞介导的天然免疫活化过程中发挥关键调控作用。已有研究证实CD45、IRF5等免疫相关基因的剪接变异可直接重塑免疫细胞功能，且剪接异常与类风湿关节炎等自身免疫疾病密切相关。然而当前研究领域仍存在技术局限，如传统短读长测序仅能捕获碎片化片段，无法完整捕获全长异构体，难以系统解析单核细胞活化全局剪接图谱，大量新型、功能相关异构体长期被遗漏。
针对上述问题，本研究利用Nanopore全长转录组技术系统绘制单核细胞静息与活化状态下的全长异构体图谱，系统解析活化诱导的可变剪接重塑规律，并结合多组学手段阐明剪接亚型切换调控免疫效应蛋白翻译的分子机制。
二、研究结果
（一）单核细胞活化后显著上调剪接通路相关基因
研究采集8例健康供体的CD14+单核细胞，分别设置LPS刺激3h处理组与未刺激对照组，开展短读长转录组测序，PCA分析结果显示LPS处理可解释98%的样本转录组变异（图1a）。LPS处理活化后，超过一半的基因出现差异表达，其中25.51%的基因表达上调，27.99%的基因表达下调（图1b）。GO富集分析显示RNA剪接、可变剪接调控相关通路显著富集，大量剪接因子相关基因在LPS刺激后表达显著上调（图1c-d）。同时聚类结果显示，对照和LPS处理样本可被剪接因子相关基因的表达模式完全分离（图1e-f）。为明确该变化在体内生理环境中同样存在，研究调取人体内LPS刺激外周血单核细胞的公共数据集（GSE87290）进行交叉验证，结果显示体内样本同样观察到剪接相关基因普遍上调（图1g）。在此基础上，研究进一步开展功能验证，通过小分子抑制剂调控剪接因子SRSF的磷酸化水平，并同步检测单核细胞活化标志物TNF-α的mRNA与蛋白水平，结果显示抑制剪接因子磷酸化可剂量依赖性地下调TNF-α表达（图1h-k）。上述结果证实剪接调控对单核细胞激活具有功能性意义。
图1
（二）Nanopore全长转录组测序鉴定出大量新型异构体
研究利用FLAIR流程分析Nanopore全长转录组数据，共鉴定出24,939条异构体，其中62%（约15,460个）的异构体属于现有数据库（对比GENCODE参考数据库）未被注释的新异构体（图2b）。将所鉴定到的新异构体与已发表的血液免疫细胞长读长转录组TRAILS和FLIBase数据库相比，分别有74%和68%的新异构体含有全新剪接连接位点，转录本长度统计显示新异构体的整体长度显著长于GENCODE数据库中参考转录本（图2c）。研究进一步利用SQANTI3软件对全部异构体进行分类，结果显示37.89%为完全匹配参考的FSM亚型，13.07%为不完全匹配的ISM亚型，42.9%的异构体属于全新亚型（全新剪接组合或包含全新剪接位点，NIC或NNC亚型）（图2d）。对比GENCODE注释与新异构体的剪接事件分布发现，新异构体中可变5’端（A5）和可变3’端（A3）剪接事件比例更高（图2e）。进一步统计显示64.6%的基因可表达至少一种异构体，46%的基因新异构体数量超过GENCODE注释的转录本亚型（图2f）。综上新发现的异构体显著拓展对单核细胞转录组复杂性的认知。
图2
（三）单核细胞活化触发全局性异构体切换
研究进一步对比对照组和LPS处理组的异构体表达谱，结果证实转录本表达存在特异性，如24.6%的异构体仅在静息单核细胞（对照组）表达，16.8%的异构体仅在LPS活化后表达（图3a）。差异分析共筛选出7,100个异构体和2,915个基因，其中新异构体占比高达60%（图3b）。此外，研究共鉴定到686个异构体转换事件，超过半数基因仅发生异构体比例转换，总基因表达无显著差异，如部分基因PPP2R2D、NLRP3（图3d），且这类基因显著富集天然免疫激活、细胞因子产生等免疫相关通路（图3e）。为验证上述结论准确性，研究进一步通过两个独立的公共短读长RNA-seq数据集进行分析，结果发现RNA-seq数据集中同样观察到一致的异构体转换模式（图3f）。差异可变剪接分析显示，LPS活化后外显子跳跃事件增加，内含子保留事件减少（图3g）。上述结果证明，单核细胞活化会驱动异构体使用重塑，大量功能调控变化仅存在于异构体层面，无法通过传统RNA-seq捕获。
图3
（四）LPS活化驱动单细胞倾向于使用更长、更具功能性的异构体
为解析活化后异构体转换带来的功能转变，研究系统对比对照组与处理组的异构体结构与编码特征。结果显示，经LPS刺激后，单核细胞整体偏好使用更长的异构体，其外显子数量更多并具有更完整的开放阅读框（ORF）、更长的3’UTR以及更少的内含子保留（图4a）。编码潜能层面，LPS活化后，可编码的功能性异构体占比增加，易发生无义介导mRNA降解（NMD）的异构体比例降低；异构体拓扑复杂度、蛋白结构域数量也均同步提升（图4b）。其中LPS活化后编码最长ORF的异构体和无提前终止密码子的功能性异构体使用比例均显著增加（图4c-d）。
为建立异构体特征与翻译水平的关联，研究整合THP-1细胞系的Ribo-seq公共数据集（GSE208041）开展分析，证实活化后优势异构体具备更强的核糖体结合信号（图4e）。研究进一步通过质谱蛋白质组数据验证，结果显示若基因在激活后功能性异构体的使用比例增加超过25%，对应的蛋白质丰度也显著高于其他基因，该结论在独立公共蛋白质组数据集（PXD004352）中也得到验证（图4f）。此外研究采用蛋白语言模型ESM1b分析也证实，活化后优势异构体具有更高的加权伪似然得分（图4g）。
综合多组学证据证明，单核细胞活化后会系统性切换至翻译效率更高、蛋白功能更完善的异构体，从转录后层面放大免疫效应分子的蛋白产出。
图4
（五）以炎症小体核心基因NLRP3为范例，验证活化诱导的可变剪接调控机制
研究基于Nanopore全长转录组测序共鉴定出NLRP3基因9个未注释的新异构体，涉及外显子跳跃、内含子保留和可变3’端等多种剪接事件（图5a）。LPS活化后，NLRP3基因整体表达上调（图5b），同时发生显著的异构体转换，由缺失一个或多个外显子的短异构体转向包含全部经典外显子的长异构体，其中编码最长ORF的异构体（如ENST00000697350）使用比例显著增加（图5c-e）。此外，剪接抑制剂处理可逆转这些异构体转换事件，两个独立的短读长数据也验证了LPS处理后外显子包含事件上调的特征（图5f）。qPCR和凝胶电泳进一步证实外显子5、6、7包含水平的上升，Western blot也显示长异构体对应的蛋白表达上调（图5g-h）。综上从转录与蛋白双重层面佐证可变剪接对炎症小体核心分子的调控作用。
图5
三、结论
本研究基于Nanopore全长转录组测序技术，首次系统绘制静息与LPS活化状态下人原代单核细胞全长异构体全景图谱，完整解析先天免疫激活阶段多层次可变剪接调控网络。研究证实，单核细胞免疫应答存在双重转录调控模式，既发生全基因组基因表达重塑，更伴随全局性异构体切换。静息状态细胞倾向于表达较短、编码能力弱且易降解的异构体；经LPS刺激活化后，细胞会表达完整开放阅读框、蛋白结构域丰富、翻译效率更高的功能性异构体。这一发现充分证明可变剪接是独立于基因表达、调控先天免疫应答的关键转录后层级，仅依靠传统短读长基因水平分析会遗漏大量核心功能调控事件。
参考文献
Bodelón A, van Haaren MJH, Sobrevals Alcaraz P, et al. Native long-read RNA sequencing of human monocytes reveals activation-induced alternative splicing toward functional isoforms. Nat Commun. Published online May 29, 2026. doi:10.1038/s41467-026-73661-5
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